VITRIFICAÇÃO E CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS SECUNDÁRIOS OVINOS: UMA ALTERNATIVA PARA A PRESERVAÇÃO DA FUNÇÃO REPRODUTIVA DE FÊMEAS - LUNARDI, FRANCIELE OSMARINI (2015)
A criopreservação de folículos pré-antrais presentes no tecido ovariano (TO) tem sido utilizada com sucesso para restaurar a função reprodutiva após transplante, principalmente em mulheres submetidas a tratamentos gonadotóxicos. No entanto, o transplante do TO pode promover a reintrodução de células cancerosas. Desta forma, a utilização de folículos secundários (FS) (folículos pré-antrais em desenvolvimento) isolados do TO pode ser uma alternativa para evitar esse inconveniente. O principal objetivo desta tese foi identificar a melhor forma (isolada ou inclusa no TO) de vitrificação de FS ovinos para posterior cultivo in vitro e obtenção de oócitos maduros, visando à produção in vitro de embriões. Para isso, os FS foram avaliados in vitro após vitrificação em três diferentes fases: Fase I: Vitrificação de FS inclusos ou isolados do TO seguido de cultivo in vitro de curta duração (6 dias); Fase II: Vitrificação de FS inclusos ou isolado do TO seguido de cultivo in vitro de longa duração (18 dias) e maturação in vitro (MIV) e Fase III: Uso de diferentes meios (α-MEM ou TCM199) para o cultivo in vitro de FS vitrificados inclusos ou isolados do TO, MIV e expressão gênica de CX37, CX43, BAX e BCL2. Os dados foram submetidos ao teste de normalidade de Bartletts e/ou Shapiro-Wilke, as médias comparadas pelo teste de Tuckey e/ou Students Newman Keuls, variáveis discretas ao Qui quadrado ou ao teste exato de Fisher, todos a uma probabilidade de erro menor que 5%. Na Fase I, observamos que FS vitrificados na forma isolada foram capazes de crescer, semelhantemente aos folículos frescos (P<0,05). Além disso, parâmetros como a morfologia, ultraestrutura, viabilidade, proliferação celular e percentual de formação de antro foram similares (P<0,05) entre os folículos vitrificados isolados ou inclusos no TO. Na Fase II, oócitos oriundos de folículos vitrificados na forma isolada retomaram a meiose a atingiram metáfase I (MI) semelhante aos folículos frescos ou não vitrificados (P>0,05). Na Fase III, observou-se que o meio α-MEM foi fundamental para a retomada da meiose e metáfase II (MII). A expressão gênica para BAX e CX37 foi observada apenas nos folículos frescos cultivados em α-MEM ou em TCM199. Já para o BCL2 a expressão foi significativamente superior nos folículos vitrificados no TO, cultivados em ambos os meios comparados aos demais folículos. Com relação à CX43, a expressão nos folículos frescos foi superior a dos vitrificados. Conclui-se que: 1) FS podem ser vitrificados com êxito antes ou depois do isolamento do TO, sem prejuízos para a morfologia e capacidade de formar antro após cultivo in vitro por 6 dias. No entanto, a ultraestrutura de folículos vitrificados é mais comprometida do que folículos frescos; 2) Oócitos provenientes de FS vitrificados na forma isolada e, cultivados in vitro por 18 dias se desenvolveram até o estágio de MI; 3) Ao final da MIV, o diâmetro oocitário não foi afetado pela vitrificação folicular ou meio utilizado; 4) Oócitos maturados in vitro provenientes de folículos vitrificados na x forma isolada e cultivados in vitro em α-MEM se desenvolveram até o estágio de MII e 5) A expressão gênica foi afetada pela vitrificação. Palavras - chave: Criopreservação. Tecido ovariano. Folículo isolado. Vitrificação. Maturação in vitro.