ANÁLISE MOLECULAR POR PCR EM TEMPO REAL PARA A IDENTIFICAÇÃO DA PREFERÊNCIA ALIMENTAR DE FLEBOTOMÍNEOS TRANSMISSORES DAS LEISHMANÍASES - MAGALHÃES, RAFAELA DAMASCENO (2016)
RESUMO A investigação do hábito alimentar de flebotomíneos tem grande significado ecológico e epidemiológico. Diferentes metodologias, incluindo uso de técnicas sorológicas, foram utilizadas para identificação das fontes de repasto. Contudo, abordagens moleculares com elevada sensibilidade e especificidade têm se sobressaído como importantes ferramentas nessa área. Estratégias de amplificação de genes mitocondriais, como o citocromo b, através de PCR convencional ou PCR em tempo real vêm sendo empregadas com elevados índices de detecção. No entanto, a inadequada especificidade das abordagens de amplificação gênica empregadas demanda a utilização conjunta de técnicas auxiliares que contribuem para aumentar o tempo de execução e os custos do processo. Assim, uma estratégia metodológica ideal deve ser capaz de aliar alta sensibilidade de detecção, especificidade compatível para repasto sanguíneo em múltiplas espécies animais, além de baixo custo. Nesse sentido, o presente trabalho objetivou desenvolver uma nova abordagem de PCR em tempo real com SYBR Green baseada na amplificação das regiões do genoma mitocondrial (WMG-qPCR) que são menos conservadas entre humanos (Homo sapiens), caninos (Canis lupus familiaris), felinos (Felis catus), murinos (Rattus novergicus) e galináceos (Gallus gallus). Para tanto, na primeira etapa experimental, três protocolos de extração de DNA foram ajustados e adequados para que se obtivessse amostras de DNA mitocondrial (mtDNA) com rendimento e qualidade adequada para uso na WMG-qPCR. Na segunda etapa experimental, a especificidade das amplificações foi testada através de ensaio de reação-cruzada com o DNA das espécies animais. A sensibilidade das reações foi determinada por construção de curvas-padrão com concentrações de DNA equivalentes a 0,1 x 106 a 1 μl de sangue extraído a partir de cada espécie animal. O DNA de flebotomíneos machos da espécie Lutzomyia longipalpis também foi utilizado nas reações para a exclusão de falsos positivos. Dentre os principais resultados destacaram-se o kit baseado em ligação de DNA total em resina de sílica que foi capaz de obter maior quantidade de mtDNA; a metodologia WMG-qPCR que apresentou alta sensibilidade e espécie-especificidade sendo capaz de promover a detecção de 26, 84, 130, e 320 fg DNA em 10 pL de sangue de felino, humano, canino e murino, respectivamente; além disso, foi capaz de amplificar 5pg de DNA em 5 pL de sangue de galináceo. Assim, a metodologia WMG-qPCR se apresentou como importante ferramenta para investigação de repasto sanguíneo, devido a sua capacidade de diferenciar possíveis fontes preferenciais de Lutzomyia spp. Palavras chave: Repasto sanguíneo, Lutzomyia, Leishmania, qPCR, Leishmaníases.