Criopreservação e cultivo in vitro de tecido testicular como alternativa para a conservação do material genético de ovinos da raça Morada Nova - Ygnacio, Rensson Homero Celiz (2023)
O principal objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do método de criopreservação (congelação lenta e vitrificação) e do sistema de cultivo in vitro (bi e tridimensional) sobre a retomada funcional de fragmentos de testículos de ovinos pré-púberes e adultos da raça Morada Nova. Para isso, o estudo foi dividido em três fases: Fase I: Congelação lenta e vitrificação de fragmento de testículos de ovinos pré-púberes e adultos; Fase II: Cultivo in vitro por 48 h em sistema bidimensional (2D) ou tridimensional (3D) de fragmentos de testículos frescos de ovinos adultos; e Fase III: Cultivo in vitro por 48 h em sistema bidimensional (2D) ou tridimensional (3D) de fragmentos de testículos congelados de ovinos adultos. Em todas as fases foram utilizados fragmentos de 9 mm³ (3×3×1 mm) e aleatoriamente distribuídos nos diferentes tratamentos: [Fase I: fragmento fresco ou controle (CTR); fragmento criopreservado por congelação lenta (CL) ou vitrificação (VIT); Fase II: fragmento não cultivado ou controle (CTR); fragmento cultivado in vitro no sistema 2D (CIV2D) ou 3D (CIV3D); e Fase III: fragmento não cultivado ou controle (CTR); fragmento cultivado no sistema 2D (CIV2D) ou 3D (CIV3D); fragmento congelado (CL); fragmento congelado e cultivado in vitro no sistema 2D (clCIV2D) ou 3D (clCIVC3D)]. Os resultados da Fase I mostraram que a morfologia testicular, bem como, a imunomarcação para a β-catenina foram melhores após congelação lenta (p<0,05) do que após a vitrificação, em animais pré-púberes e adultos. Além disso, a ultraestrutura testicular de animais pré-púberes foi melhor preservada após a congelação. Na Fase II, a análise morfológica dos fragmentos mostrou maior perda celular e ruptura da membrana basal no sistema 2D (p<0,05), enquanto no sistema 3D foi observada maior condensação nuclear (p<0,05) e menor potencial para a proliferação celular (p<0,05). No entanto, sinais de fibrose tecidual no sistema 2D foram menos evidenciados (p<0,05) do que no 3D. Na Fase III, alterações epiteliais e nucleares no tratamento clCIV2D foram maiores (p<0.05) do que no clCIV3D. Nesse tratamento o percentual de fibras de colágeno tipo I e III foi similar (p>0,05) ao observado no tratamento CL. Adicionalmente, nos fragmentos apenas congelados observou-se uma drástica redução (p<0,05) do potencial proliferativo em relação ao CTR, prejudicando essa função durante o cultivo in vitro, independentemente do sistema utilizado. Os níveis de mRNA para os genes OCT4, c-KIT e STAR foram similares entre fragmentos frescos (CTR) e fragmentos congelados. Resultados similares foram observados para o OCT4 e C-KIT entre os fragmentos apenas congelados e os congelados e cultivados in vitro em ambos os sistemas. Em conclusão, de acordo com as condições experimentais nesse estudo, a congelação lenta é o método de escolha para a criopreservação de fragmentos de testículos ovinos pré-púberes e adultos. Fragmentos de testículo frescos de indivíduos adultos devem ser cultivados in vitro no sistema 2D, enquanto que o sistema 3D parece ser a melhor alternativa para os fragmentos congelados.