Detecção de Leishmania chagasi em Lutzomyia longipalpis por meio de qPCR em tempo real: triagem de genes e métodos quantitativos - Vasconcelos, Diana Romão Bezerra (2010)
A Leishmaniose Visceral é uma doença endêmica no Brasil cujo agente etiológico é o protozoário Leishmania chagasi e o principal vetor é o flebotomíneos da espécie Lutzomyia longipalpis. Estudos epidemiológicos têm utilizado a PCR convencional para mensurar a taxa de infecção de flebotomíneos coletados a campo. Entretanto, a PCR em tempo real consegue detectar cargas parasitária muito baixas, reduzindo a quantidade de falso negativo e quantificando o número de leishmânias no flebotomíneos. Este trabalho objetivou comparar genes com diferentes números de cópias para detectar e quantificar L. chagasi em diferentes pools de L longipalpis através da PCR em tempo real. Foram misturados pools de L longipalpis contendo 1, 10 e 30 exemplares machos com L. chagasi oriunda de dilução seriada, formando grupos com 50, 500, 5.000 e 50.000 parasitos. Para amplificação do DNA de L. chagasi, foram usados primers direcionados para o gene que codifica a polimerase α, a subunidade ribossomal 18S e o kDNA. A especificidade foi determinada pela análise da curva de melting após cada PCR e visualização do produto amplificado em gel de agasose a 1,5%. Os parasitos foram mensurados por quantificação absoluta e relativa. Determinou-se a lineridade (R2 ) e a eficiência (E) das reações de PCR a partir de curvas padrão geradas para cada gene usando diluições seriadas de DNA de leishmânia e flebotomíneo. As curvas padrão foram estabelecidas com amostras variando de 0,23 fg a 2,3 ng de DNA de leishmâmia e 1,46 pg a 14,6 ng de DNA de flebotomíneo. A análise da PCR demonstrou a capacidade de amplificar até 0,004 parasitas. A quantificação dos parasitos usando primers que amplificam o gene da polimerase α apresentou inexatidão, principalmente em grupos com reduzido número de leishmânias. Em relação ao gene que codifica o 18S, a estimativa foi mais exata, porém imprecisa. Os melhores resultados foram observados com os primers que amplificam o kDNA, especialmente na quantificação relativa, onde não houve interferência do tamanho do pool de flebotomíneos. A amplificação do kDNA apresentou a maior sensibilidade dentre os genes testados, bem como mensurações exatas e precisas. Palavras-Chave: Leishmania chagasi, Lutzomyia longipalpis, PCR, genes.