Desenvolvimento de nanocorpo de camelídeo do tipo vhh fc anti-fosfolipases botrópicas (bthtx-I e II) em sistema vegetal com vistas a neutralização de toxinas de serpentes do gênero Bothrops - Maia, Angela Donato (2023)
No Brasil, os acidentes ofídicos por serpentes do gênero Bothrops representam cerca de 90% dos casos. A soroterapia pode apresentar limitada eficiência na neutralização de toxinas no local da mordida e reações de hipersensibilidade. Fragmentos de anticorpos recombinantes apresentam boa penetração tecidual e seu uso tem sido sugerido para o tratamento do envenenamento ofídico. Em particular, o domínio variável do anticorpo de cadeia pesada de camelídeo, VHH ou nanocorpo, além de neutralizar toxinas nos tecidos profundos, apresentam alta capacidade de reconhecimento antigênico e atuam como potentes inibidores enzimáticos. O presente trabalho objetivou desenvolver construto de nanocorpo recombinante, do tipo VHH-Fc, capaz de reconhecer e neutralizar toxinas botrópicas por expressão transiente nas folhas de Nicotiana benthamiana. A sequência anti-BthTX-I e II foi obtida em nosso grupo de pesquisa (GenBank KC329718). Para a obtenção da quimera, a sequência do VHH foi fusionada a região Fc humana e otimizada para expressão em N. benthamiana. Em seguida, a sequência foi clonada em vetor pCamGate e transformada em A. tumefaciens. Após a infiltração da bacteria, foi realizada a coleta das folhas e extração das proteínas totais. Subsequentemente, o VHH-Fc anti-fosfolipases botrópicas (bVHH-Fc) foi purificado por cromatografia de afinidade em coluna de proteína G. A avaliação do perfil eletroforético, conduzida por SDS-PAGE, indicou bandas de 60 kDa, correspondente ao monômero, e de ~120 kDa, correspondente ao construto dimérico. Ainda, o bVHH-Fc demonstrou capacidade de reconhecimento antigênico das toxinas BthTX-I e BthTX-II isoladas e do veneno de B. jararacuçu em Western Blot (WB) e ELISA. Subsequentemente, a análise de estabilidade térmica demonstrou que o bVHH-Fc se manteve estável a 4ºC pelo período de três meses e a sequência foi confirmada por espectrometria de massas. Testes in vitro na linhagem celular C2C12 indicaram capacidade de neutralização das toxinas ofídicas (BthTX-I e BthTX-II) e veneno bruto, com inibição superior a 80% (p0,0001) dos níveis de LDH desencadeados por BthTX-I e iguais a 80% (p0,01) em relação ao veneno bruto. Nas análises in vivo, em camundongos, o bVHH-Fc foi capaz de inibir em 59% a miotoxicidade induzida pelo veneno de B. jararacussu, avaliada pela dosagem de creatino quinase (CK). Adicionalmente, o bVHH-Fc apresentou inibição do LDH em níveis iguais ou superiores a 72%, com diferença significativa (p0,0001) em relação ao controle grupo não tratado, administrado apenas o veneno bruto. Os resultados sugerem que o VHH-Fc produzido em sistema vegetal é funcional e capaz de neutralizar toxinas ofídicas, com grande potencial para uso em vítimas de serpentes do gênero Bothrops. Palavras-chave: toxinas de serpentes; antivenenos; nanocorpos e vhh-fc; expressão transiente; nicotiana benthamiana.