Glicoproteínas de superfície invariantes de trypanosoma evansi: determinação das utrs de seus genes e transcritos e construção de uma proteína quimérica recombinante - Neves, Gabriella Bassi das (2023)
Os tripanossomas encontrados em mamíferos, incluindo humanos, pertencem ao gênero Trypanosoma, à família Trypanosomatidae e à ordem Cinetoplastida. No Brasil, Trypanosoma evansi é distribuído por todo o território nacional. T. evansi é um hemoprotozoário unicelular, eucariótico e flagelado e está sempre na forma de tripomastigota. Possui arquitetura celular com núcleo sistema mastigonte, representado pelo corpo basal e pelo flagelo. O sistema especializado de membranas internas é essencial para a remoção e adição de proteínas da membrana via exocitose/endocitose. Isso permite a manutenção da composição das glicoproteínas da superfície celular, garantindo a evasão da resposta imune do hospedeiro. Uma das principais estratégias do parasito é a variação antigênica, na qual o principal constituinte da superfície celular, a glicoproteína de superfície variante (VSG – variable surface glycoprotein), passa por remodelamento frequente, dando vantagem sobre o sistema imunológico e evitando reconhecimento e eliminação. Diferente das VSGs, as glicoproteínas de superfície invariante (ISGs – invariant surface glycoprotein) não apresentam variação antigênica, o que as torna possíveis alvos de estudos para testes de diagnóstico. Além disso, são proteínas imunogênicas e acredita-se estarem envolvidas com mecanismo da captação de suramina a partir da endocitose via ligação à ISGs75. O desenvolvimento de técnicas imunológicas utilizando as ISGs como alvo é importante para permitir um diagnóstico rápido, preciso e específico na detecção de T. evansi. A partir disso, um dos objetivos do trabalho foi produzir uma proteína quimérica incluindo os epítopos das ISGs75 de T. evansi e determinar a imunogenicidade utilizando testes de imunodiagnóstico, com intuito de utilizar esta proteína recombinante como alvo para teste de diagnóstico e produção de anticorpos específico anti-T. evansi. Na identificação dos epítopos utilizou se diferentes ferramentas de bioinformática, que permitiram projetar e sintetizar peptídeos sintéticos a partir das ISGs75. Além disso, o trabalho teve também como objetivo estudar a UTRs para determinação de sequência gênica das ISGs75 e da sequência líder de T. evansi para diagnóstico molecular. A síntese dos peptídeos obtidos das ISGs75 de T. evansi demostraram-se imunogênicos pelas técnicas de imunofluorescência indireta e western blotting. O pepISG2 demostrou maior reatividade antígeno-anticorpo, em ambas as técnicas. A partir destes resultados, projetou-se uma proteína quimérica com base nas mesmas sequenciais dos peptídeos sintetizados, a qual foi expressa utilizando o vetor pET31 e Escherichia coli BL21. A lise celular permitiu a obtenção dos corpos de inclusão que foram solubilizados em tampão de ureia e purificados por cromatografia de afinidade utilizando coluna de níquel. A partir das técnicas de western bloting e dot blot foi possível o reconhecimento da proteína quimérica, confirmando a imunogenicidade do peptídeo presente no soro anti-pepISG2. Para o estudo das UTRs das ISGs75 e determinação da sequência gênica das ISGs75 e da sequência líder de T. evansi foram projetados oligonucleotídeos iniciadores para identificar a UTR utilizando as sequências depositadas no TrytripD. A partir da obtenção do DNA, amplificação e clonagem dos genes da família de ISGs75 foi possível a partir dos resultados de sequenciamento identificar os sítios de trans-splicing canônico (AG), entretanto outros dinucleotídeos também estão sendo utilizados (GG e CC) como os sítios de splicing. Os resultados de sequenciamento foram utilizados para o desenho de novos primers, um deles reconhecendo a sequência líder de T. evansi e outro dentro da ORF (fase aberta de leitura). Da mesma maneira houve amplificação e clonagem, entretanto, utilizando cDNA, com intuito de identificar a sequência das ISGs75 e da sequência líder do organismo em estudo. Desta forma, o presente trabalho enfatiza a importância do estudo das ISGs75 e o uso da proteína 8 quimérica para o diagnóstico rápido e específico de T. evansi. Além disso, identificação da sequência líder pode ser útil no diagnóstico molecular do parasito.