Ensaios de biotransformação da atrazina e avaliação dos seus efeitos espermáticos em peixe - Bautista, Félix Esteban Airahuacho (2017)
A atrazina (ATZ) é um agrotóxico utilizado na agricultura para controlar ervas daninhas. A sua utilização em larga escala, seu escoamento e lixiviação, tornaram-lhe um dos contaminantes de maior presença no ambiente aquático. Enzimas de biotransformação como o citocromo P450 (CYP) e a glutationa S-transferase (GST) participam de sua detoxificação. A atividade destas enzimas pode se mostrar aumentada nos organismos aquáticos expostos a contaminantes ambientais. A ATZ pode ainda causar efeitos nocivos ao nível reprodutivo em mamíferos, anfibos e peixes. Os prováveis mecanismos envolvidos nestes efeitos, incluem a modulação de vias esteroidogênicas pela ATZ, através do incremento da AMPc por inibição da fosfodiesterase, assim como a modução de múltiplas vias bioquímicas fundamentais da gametogênese e ovulação. Outro efeito negativo da ATZ seria a produção adicional de espécies reativas de oxigênio com conseqüente aumento de danos em estruturas celulares e DNA. A presente tese está estruturada em dois capítulos com os seguintes objetivos: 1) estimar a biotransformação de ATZ via GST em camarão e peixes de ambiente contaminado e cativeiro (referência), utilizando três abordagens: ensaio cinético da GST com substrato de amplo espectro (CDNB), ensaio cinético competitivo entre CDNB e ATZ e ensaio cinético de decaímento da ATZ, analisada por cromatografia líquida e espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS); e 2) avaliar efeitos da exposição à ATZ sobre os parâmetros de qualidade espermática e na regulação transcricional de genes-alvo relacionados a estes parâmetros em peixe-zebra (Danio rerio). Para o primeiro capítulo, foram utilizados extratos citosólicos de brânquia e hepatopâncreas de camarão Litopenaeus vannamei e brânquia e fígado de peixe Poecilia vivipara. Ensaios cinéticos com variações nas concentrações de CDNB e ATZ foram realizados a fim de construir gráficos de Lineweaver-Burk que permitiram inferir que a inibição causada pela ATZ era do tipo competitivo. A atividade basal estimada por ensaio cinético com CDNB sugeriu maior capacidade de detoxificação via GST em peixe que em crustáceo, maior em fígado que em brânquias e maior em peixe de local contaminado que de cativeiro. Padrões similares foram encontrados quando foi avaliado o decaimento da ATZ por LC-MS/MS. Por outro lado, a capacidade de biotransformação estimada pelo ensaio competitivo, utilizando CDNB e ATZ como substratos de competição, sugere maior atividade de GST com afinidade por ATZ em crustáceo que em peixe, e maior em peixes de cativeiro que de local contaminado. Aparentemente, os dois primeiros ensaios citados, foram mais apropriados para indicar a capacidade de biotransformação do que o ensaio competitivo. A inespecificidade do ensaio competitivo utilizado pode ter relação com a presença de diferentes isoformas de GST nas matrizes biológicas testadas. Para o segundo objetivo, peixes D. rerio foram expostos as concentrações nominais de ATZ de 0, 2, 10 e 100 µg.L-1 durante 11 dias. As concentrações de 2, 10 e 100 µg.L-1 ATZ testados causaram diminuição em diversos parâmetros espermáticos, como motilidade, funcionalidade mitocondrial e integridade de membrana, em relação ao grupo controle, porém não houve efeito na integridade do DNA. A repressão da expressão de genes relacionados da espermatogênese (SRD5A2 e CFTR) e proteção celular (SOD2, GPX, XPC) em gônadas de grupos expostos à ATZ sugerem que a ATZ afeta as vias gametogênicas e de proteção na gônada, podendo ser uma das possíveis causas para a redução da qualidade espermática. No fígado, a ATZ ativou a expressão de genes de detoxificação e antioxidante (CYP1A, GSTP e SOD2). Fatores de transcrição tais como AHR e NF-B, podem estar sendo ativados pela presença da ATZ e seus produtos oxidativos, e podem representar possíveis mecanismos de regulação transcricional envolvidos nestas respostas. Em suma, o presente estudo sugere que a capacidade de biotransformação de ATZ via GST é espécie-específica, órgão-específica e maior em peixes que habitam ambiente contaminado. Também sugere que concentrações ambientalmente relevantes de ATZ causam efeitos significativos ao nível reprodutivo em peixes macho, e que estes efeitos podem estar associados à regulação transcricional de genes-chave associados à espermatogênese e proteção celular.