Aplicação de líquidos iônicos : estabilidade e propriedades catalísticas de protease queratinolítica - Borba, Thais de Matos (2015)
A alta quantia de coprodutos residuais queratinosos depositados no meio ambiente desencadeou o desenvolvimento de processos biotecnológicos com enzimas queratinolíticas. O emprego de líquidos iônicos (LI) é apontado como uma nova tecnologia podendo aprimorar a estabilidade de enzimas. No presente trabalho, a queratinase foi tratada em LI para investigar o efeito na estabilidade térmica e atividade catalítica. A enzima foi obtida a partir do gênero Bacillus sp. P45, purificada por sistema aquoso bifásico seguido de ultrafiltração/diafiltração e liofilizada. A termoestabilidade da enzima foi avaliada nos LIs [Mmim][CH3SO4], [TEAA], [Bmim][PF6] e [Emim][Tf2N]. O tratamento da enzima foi realizado sob agitação magnética a 4ºC por 30 min. Adicionalmente foi feito uma comparação da estabilidade enzimática no LI selecionado com os preservativos polietilenoglicol 1500 54% e o uso conjunto de sorbitol 50% e CaCl2 5 mmol.L-1, com tempo de incubação de 15 e 60 min a 55ºC e de 15 min a 70ºC. Na sequência foi determinado os parâmetros cinéticos (meia vida e constante de desnaturação) e as propriedades térmicas por calorimetria diferencial de varredura (DSC) da enzima tratada em [Emim][Tf2N] e forma liofilizada. O efeito na atividade catalítica da enzima tratada foi determinado através do estudo da concentração de [Emim][Tf2N] no meio reacional, da temperatura e pH ótimos tanto no LI como nos preservativos e ainda pela adição dos solventes orgânicos acetona, etanol e isopropanol, nas concentrações de 25 e 50% (v/v) (solvente/enzima tratada no LI). No ensaio contendo o solvente orgânico e LI foi calculado a constante de Michaelis-Menten (KM) e a velocidade máxima (Vmáx). O LI selecionado como melhor estabilizante da queratinase foi o hidrofóbico [Emim][Tf2N], com o melhor efeito em 70ºC, reduzindo 16% da atividade inicial após 15 min, enquanto que tratada em sorbitol+CaCl2 a redução foi de 38%. A meia vida a 70ºC determinada para a enzima tratada em polietilenoglicol 1500, sorbitol+CaCl2 e [Emim][Tf2N] foi de 2,2 min, 28,9 min e 6,4 h, respectivamente, e de 6,4 h para sorbitol+CaCl2 e 3,0 h para polietilenoglicol, a 55ºC. A 55ºC a enzima tratada em LI teve pouca redução na atividade, mantendo 70% da inicial por 32 dias. Na análise de DSC, a enzima foi melhor estabilizada termodinamicamente quando tratada em [Emim][Tf2N], mantendo a sua integridade molecular até a temperatura de 143,2ºC. A concentração de LI adicionado no meio reacional que conduziu a maior atividade foi 4,5% (v/v). A temperatura ótima da enzima tratada no LI [Emim][Tf2N] e em sorbitol+CaCl2 foi de 50 e 60ºC, e pH ótimo igual a 8,0 e 8,5, respectivamente. A enzima tratada em 50% (v/v) do LI e acetona, adicionados ao meio reacional com concentração de LI igual a 2,3% (v/v) aumentou 1,5 vezes o valor da atividade, com KM de 0,94 mg.mL-1 e Vmáx de 25,9 U.mg-1. Portanto, o LI [Emim][Tf2N] foi capaz de estabilizar a queratinase e a adição de acetona permitiu utilizar uma menor quantidade deste LI, obtendo maior atividade.