Peptídeos ovicidas de Moringa oleifera Lamarck: isolamento, caracterização bioquímica e alvos de ação no modelo biológico Haemonchus contortus. - SOUSA, A. M. P. (2016)
Resumo: Haemonchus contortus, principal helminto endoparasita de caprinos e ovinos, é uma espécie de alta patogenicidade que tem apresentado resistência múltipla a diversas classes de drogas anti-helmínticas. Frente à limitação de controles químicos eficazes, tem-se estimulado a busca por novas opções de tratamento. Em função de seus potenciais terapêuticos, eficiência e especificidade, os peptídeos destacam-se na área de pesquisas que visam à produção de biofármacos. Investigações de algumas espécies vegetais têm revelado interessantes potencialidades nematicidas. Moringa oleifera Lam. (Moringaceae) é uma espécie vegetal conhecida por suas diferentes propriedades farmacológicas, cujos efeitos anti-helmínticos foram recentemente reportados. O objetivo do presente estudo consistiu em identificar compostos de natureza proteica presentes em sementes de moringa, ativos contra o parasita gastrintestinal H. contortus. Após obtenção de um extrato proteico que exibiu potente atividade ovicida (96 ± 0,8%), etapas de separações por membranas (cut off 12 e 2 kDa) mostraram que o efeito observado era devido, exclusivamente, a moléculas de baixa massa molecular (< 12 kDa), sendo essas, tanto de origem proteica como não proteica. A fração proteica dotada de atividade ovicida foi capaz de inibir em 82 ± 1% a taxa de eclosão de ovos de H. contortus e apresentou-se como banda única, de massa molecular aparente de 6,5 kDa sob condições redutoras. Além da ação ovicida, os peptídeos também apresentaram forte efeito floculante in vitro e foram altamente resistentes à proteólise permanecendo ativos mesmo após 24 horas de digestão com pronase E. Atuação como inibidores de proteases também foi atribuída ao acervo funcional das moléculas. Atividade antipapainásica (99 ± 0,2%) e antitripsínica (41 ± 11%) foram alcançadas utilizando-se 50 e 100 µg de proteínas, respectivamente. A determinação de uma EC90 para atividade floculante (0,812 µg) cerca de 250 vezes menor do que a EC90 para atividade ovicida (202,3 µg) foi um resultado relevante, uma vez que, a existência de correlação positiva entre às diferentes atividades possibilitou o uso do teste de floculação como forma alternativa de detectar a presença dos peptídeos ovicidas ao longo das etapas de purificação. A eluição da fração ativa através de cromatografia em matriz de troca iônica permitiu a separação da mesma em moléculas distintas obtidas através de variações de gradiente iônico. Assim, a fração ativa inicial mostrou ser, na verdade, uma mistura de peptídeos com pelo menos quatro isoformas moleculares que exibiram massas semelhantes em torno de 6,5 kDa, distribuídas por SDS-PAGE, e com elevado grau de pureza detectado por HPLC. Análises espectroscópicas revelaram ainda que três das isoformas obtidas possuem espectros de CD com mínimos e máximos típicos de arranjos desordenados (70% de estruturas aleatórias), enquanto que a quarta isoforma encontrada apresentou padrão conformacional distinto, exibindo arranjos em alfa hélice como conteúdo dominante (69%), porém com ocorrência de estruturas não ordenadas bastante representativas (31%). Quanto ao modo de ação, observou-se uma significativa inversão do efeito ovicida quando o material foi ensaiado em solução cuja força iônica foi alterada para 0,15 M na presença de NaCl. A relação entre as atividades floculantes e ovicidas foi investigada e mecanismos de interações eletrostáticas foram apontados como requisito comum ao desempenho funcional das moléculas. Os resultados aqui obtidos revelam novas e importantes aplicabilidades funcionais para um grupo de peptídeos já bastante explorado por seus efeitos floculantes, sendo essas moléculas candidatas em potencial para atuarem no controle alternativo de helmintoses. Abstract: Haemonchus contortus is the most dominant endoparasite of sheep and goats, causing huge economic losses. Several anthelmintics have been used to minimize the losses caused by parasitic infection. However, anthelmintic resistance in nematodes has become a major practical problem in many countries and has stimulated the search for alternative and environmentally acceptable control methods, such as bioactive compounds from medicinal plants. The current study reports on the purification and partial characterization of bioactive peptides from Moringa oleifera seeds with ovicidal activity against H. contortus. The purification protocol entailed obtaining an aqueous extract, steps of separations by membranes (cut off 12 and 2 kDa) and ion exchange chromatography. The protein material obtained was subjected to egg hatch assay, flocculant activity, protease inhibition and resistance to proteolysis. Subsequent characterization was performed using SDS-PAGE electrophoresis, high performance liquid chromatography (HPLC) and circular dichroism (CD). The aqueous seed extract from M. oleifera seeds exhibited ovicidal effect inhibiting 96 ± 0.8% of egg hatching rate of H. contortus. Anthelmintics peptides, isolated from the total aqueous extract showed 82 ± 1% ovicidal activity (EC90 of 202.3 µg) and presented a single band of apparent molecular mass of 6.5 kDa under reducing conditions. Furthermore, they showed in vitro flocculant effect (EC90 of 0.812 µg), trypsin inhibitor activity (41 ± 11%), papain inhibitor activity (99 ± 0.2%) and were highly resistant to proteolysis, remaining active even after 24 hours of incubation with pronase E. The peptides were adsorbed on cationic resin and separated in least four isoforms of similar molecular masses (6.5 kDa) distributed by SDS-PAGE, and high purity detected by HPLC. Circular dichroism analysis revealed that three of the isoforms have content of 70% random coil structures, while the fourth isoform found showed ?-helix rich structures (69%). Finally, studies involving changes in ionic strength of the medium indicated that electrostatic interactions may be a common mechanism between flocculant and ovicidal activity of the peptides. The results obtained demonstrated the discovery of peptides from M. oleifera with important anthelmintic properties and suggest an affordable and sustainable option for alternative parasite control.