Desenvolvimento e padronização de ELISA indireto para diagnóstico de Maedi-visna vírus de ovinos. - DANTAS, T. V. M. (2004)
Resumo: A Maedi-Visna (MV) pode ser diagnosticada por várias formas, como Imunodifusão em gel de agarose (IDGA), Western blot, Ensaio imunoenzimático (ELISA), Radioimunoensaio,Reação em cadeia de polimerase (PCR), O IDGA é o método recomendado pela Organização Internacional de Epizootias (OIE), porém o ELISA é o método de escolha para grande número de amostras, embora seu custo elevado, tenha dificultado a rotina diagnóstica da MV em ovinos. Por isso, pesquisas são realizadas para conseguir padronizar e comercializar um ELISA brasileiro a fim de facilitar seu uso na rotina diagnóstica. O objetivo desta pesquisa foi desenvolver e padronizar um ELISA indireto para diagnóstico da MV. O antígeno foi obtido a partir de sobrenadante de cultivo celular de membrana sinovial caprina (MSC) inoculado com o Maedi Visna Vírus (MVV) cepa K1514, submetido a três ciclos de congelamento e descongelamento, e clarificação por centrifugação a 3000 g por 40 min. A suspensão clarificada foi precipitada por polietilenoglicol 8000 (PEG), em seguida foi centrifugada a 12000 g por 60 min, o pellet foi ressuspendido em Tampão Tris-HCl (TNE) e ultracentrifugado a 42000 g por 105 min em colchão de sacarose. O pellet foi ressuspendido em PBS contendo phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF). O ELISA foi realizado em microplacas de 96 poços, com incubação de uma hora a 37 ºC e lavagens em cada etapa, o revelador foi o-phenylenediamine (OPD) por 15 min ao abrigo da luz. Para a comparação entre os testes de ELISA e IDGA foram utilizadas 175 amostras de soros. A concentração ótima do antígeno foi 2 µg/mL e a melhor diluição do soro foi 1:100. O ELISA detectou um maior número de positivos (41) que o IDGA (11), apresentando uma sensibilidade de 91%, especificidade de 82%. O ELISA apresentou uma sensibilidade melhor que o IDGA, porém a especificidade ficou abaixo do esperado, o que não inviabilizou seu uso como teste de diagnóstico do MVV. Abstract: The maedi-visna (MV) can be diagnosed by several forms, including immunodifusion in gel of agar (IDGA), Western Blotting, immunoenzimatic assay (ELISA), radioimunoassay, PCR. The IDGA is the method recommended by the Office International des Epizooties (OIE), however ELISA is the method prefered for great number of samples, but its high cost has been hindering it as the routine diagnostic technique for MV in sheep. Therefore researches are accomplished to standardize and to develop a brazilian ELISA tecnhique to facilite your use in the routine diagnostic. The objective of our research was to develop and standardize an indirect ELISA for diagnosis of MV. The antigen was the Virus Maedi- Visna (MVV) obtained from the supernatant of cellulr cultivation of sinovial goat membrane (SGM) inoculated strain K1514, that submited to three cycles of freezing and thawing, soon after it was clarified by centrifugation at 3000 g for 40 min. The clarified suspension was precipitated by PEG 8000 and centrifugation at 12000 g for 60 min. The pellet was resuspended in trisHCl buffer (TNE) and layered onto a sucrose cushion by centrifugation at 42000 g for 105 min. The pellet was resuspended in PBS containing phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF).The ELISA was perform in plates of 96 wells, by incubation for 1 h at 37 ºC, and washes between steps. The discloser used was the o-phenylenediamine (OPD) for 15 min to the shelter of the light. The tests were compared using the results from 175 serum samples. The great concentration of the antigen was 2 µg/mL and the best dilution of the serum was 1:100. The ELISA detected a larger number of positive (23,4%) than IDGA (6,3%), presenting a better sensibilty than IDGA however the specificity was below than the expected, what didn´t make unfeasible its use a test for diagnosis of MVV.