Diversidade fenotípica e genotípica do rizóbio que nodula o feijoeiro em solos tropicais brasileiros. - STRALIOTTO, R. (1999)
O feijoeiro se constitui numa importante cultura de subsistência e principal fonte de proteínas na dieta de populações pobres, especialmente na América Latina e África. Sua associação com as bactérias do grupo dos rizóbios é uma importante alternativa para o fornecimento de nitrogênio à planta, perfeitamente adaptado ao sistema produtivo de subsistência, predominante nesta cultura. No entanto, a tecnologia de inoculação com o rizóbio, em feijoeiro, continua com baixo índice de adoção junto aos agricultores, devido, principalmente, a inconsistência dos resultados obtidos em condições de campo. Recentemente percebeu-se que as estirpes de rizóbio que vinham tradicionalmente sendo recomendadas como inoculante para o feijoeiro eram inadequadas às condições tropicais. A tolerância a temperaturas elevadas tem sido um dos fatores levantados como limitantes a fixação biológica de nitrogênio nesta simbiose, afetando tanto a planta hospedeira quanto a bactéria. Os estudos da diversidade e taxonomia bacteriana, especialmente aplicados aos simbiontes do feijoeiro apresentaram uma grande evolução nos últimos anos, especialmente devidos às novas metodologias moleculares de avaliação e caracterização. Novas espécies de rizóbio foram descritas e caracterizadas como resultado de diversos levantamentos. Atualmente, o rizóbio que nodula o feijoeiro pertence às espécies: R. leguminosarum bv. phaseoli, R. tropici, R. etli, R. gallicum e R. giardinii. Neste estudo, foi feito um levantamento da diversidade do rizóbio presente em solos com longo histórico de cultivo do feijoeiro, dos Estados da Bahia e Espírito Santo. O rizóbio foi recuperado do solo utilizando o feijoeiro (Phaseolus vulgaris) e a leucena (Leucaena leucocephala) como plantas-isca, uma vez que esta é eficiente na recuperação de estirpes de R. tropici, consideradas mais adaptadas às condições tropicais. O rizóbio foi recuperado do solo sob duas temperaturas de crescimento das plantas-isca: temperatura ambiente e temperatura elevada (38°C durante 5 horas por dia). O tratamento de temperatura elevada visou exercer uma pressão de seleção para recuperação de rizóbio tolerante a este estresse. Os isolados recuperados dos nódulos foram avaliados quanto a infectividade, crescimento em meio LB, em meio YMA a temperatura de 39°C, e em diferentes fontes de carbono (xilose, sacarose, celobiose, frutose, lactato de sódio, glicerol e lactose). As características fenotípicas avaliadas nos testes de utilização de carboidratos foram analisadas por taxonomia numérica obtendo-se o agrupamento dos isolados em relação à estirpes padrão de rizóbio pertencentes a diferentes gêneros e espécies. Isolados representativos de cada agrupamento fenotípico obtido nesta análise preliminar de diversidade foram analisados genotipicamente por ARDRA (Análise de Restrição do DNA Ribossomal Amplificado por PCR). Na última etapa do trabalho, isolados eficientes pertencentes a cada um dos grupos de rizóbio representativos identificados na população em estudo, foram avaliados quanto à tolerância a um período de choque térmico aplicado durante três dias às raízes noduladas de feijoeiro cv. Carioca 80. Foram identificados, nesta população, três grupos distintos de rizóbio nodulando o feijoeiro, a saber: R. tropici IIA, Sinorhizobium sp. e estirpes do tipo I (R. leguminosarum bv. phaseoli/R. etli). Dentro da população recuperada de leucena, houve predomínio dos isolados de R. tropici IIA, quando a planta foi crescida a temperatura ambiente, e de Sinorhizobium sp., quando a planta foi crescida a temperatura elevada. Isolados de Sinorhizobium sp. somente foram recuperados de feijoeiro quando a planta foi crescida a temperatura elevada, sugerindo uma maior tolerância desta espécie ao estresse térmico, pelo menos no processo de infecção das raízes. Houve predomínio das estirpes do tipo I dentro da população recuperada de feijoeiro, nas duas temperaturas de crescimento das plantas. Em condições de temperatura elevada foram recuperados isolados de Sinorhizobium sp e de R. tropici IIA. Estas duas espécies não foram encontradas na população de feijoeiro crescido a temperatura ambiente. Cerca de 89% dos isolados de R. tropici e 75% dos isolados de Sinorhizobium sp foram considerados eficientes a muito eficientes, em simbiose com o feijoeiro, em comparação com a estirpe BR855. Por outro lado, dentre os isolados do tipo I, predominantes nos grupo de isolados de nódulos de feijoeiro crescido a temperatura ambiente, apenas 38% foram enquadrados nos grupos de maior eficiência. Foi grande a perda de infectividade dentro dos grupo de estirpes do tipo I, atingindo 18% dos isolados. Na etapa final do trabalho, foi avaliada a tolerância ao choque térmico dentro de cada um dos agrupamentos genotípicos. Isolados pertencentes aos principais agrupamentos mostraram tolerância a este estresse. Houve diferenças entre as estirpes para os parâmetros de nodulação, atividade da nitrogenase, acúmulo de matéria seca da parte aérea e produção de vagens. Não houve correlação entre o crescimento in vitro a temperaturas elevadas e a tolerância ao choque térmico, bem como entre a temperatura de crescimento da planta-isca de onde o isolado foi obtido e a maior eficiência sob este estresse. Beans (Phaseolus vulgaris L.) are an essencial part of the daily food of the population in Latin America because of their importance as a source of proteins. The use of biological nitrogen fixation in this culture, however, is not always profitable, and the rhizobia-common beans symbiosis has been considered inefficient due to many biotic and abiotic factors, such as low efficiency and sensitivity to high temperature and soi! acidity of indigenous rhizobia. This study aimed to evaluate the rhizobial phenotypic and genotypic diversity in tropical soils under traditional bean cultivation and submitted to very hot temperature during the summer, from the States of Bahia and Espírito Santo. Isolates were recovered using common beans and leucaena (Leucaena leucocephala) as trap hosts under low (maximum of 28°C) and high temperature regimes (38°C 5h/day). Leucaena is a high temperature tolerant plant in symbiosis and nodulates with a group of rhizobial species that also nodulates common bean. Morphophysiological characterization of the 605 isolates obtained was performed based on the utilization of 8 different carbon source and the data was analysed through numerical cluster analysis. Growth on yeast mannitol agar (YMA) medium at 39°C and on Luria broth (LB) medium was correlated for isolates from both trap hosts and most of the leucaena isolates were able to grow at 39°C. High temperatures influenced the diverstity of isolates recovered using both trap hosts, which were phenotypically more diverse at 38°C than at ambient temperature. Common beans isolates were significantly more diverse at both temperatures of recovery compared to the isolates obtained from leucaena. Representative isolates from each phenotypic greup obtained trhough the cluster analysis were genotypically analysed by ARDRA (Amplified Ribossomal DNA Restriction Analysis) using 8 different restriction enzymes. Three main different rhizobial groups were identified among the bean population: Rhizobium tropici liA, Sinorhizobium sp and Type I strains (R. leguminosarumlR. etli group). Among leucaena isolates recovered under low temperature regime R. tropici liA predominates, but at high temperature of plant growth Sinorhizobium sp. isolates occupied the majority of the nodules. Sinorhizobium sp isolates were recovered from beans only under high temperature of plant growth, which suggests a higher temperature tolerance of this group of isotates, at least at the infection process leveI. Among the bean population, Type I strains predominates at both temperature of plant growth, but at high temperature, besides Sinorhizobium sp isolates, strains of R.tropici liA were also recovered. These two species were not recovered from beans under low plant growth temperature. There was some correlation between the phenotypic and genotypic cluster analysis, but Sinorhizobium sp. isolates were phenotypically difficult to distinguish from Type I strains. The symbiotic efficiency of these groups of isolates was evaluated on beans grown at ambient temperature. The majority of R. tropici liA strains (89%) and Sinorhizobium sp (75%) strains were considered very efficient when compared to an efficient reference strain of R. tropici IIB. Among Type I strains, only 38% of the isolates belonged to the more efficient groups, and many of these isolates (18%) showed loss of infectivity after long periods of storage. At last, the most efficient isolates belonging to the main groups of each population (bean and leucaena grown at low and high temperature regimes) were evatuated for the tolerance to a heat stress in symbiosis with beans, at flowering stage. Isolates showed differences on nodulation parameters, nitrogenase activity, shoot dry matter and shoot nitrogen accumulation after the heat shock treatment (three days at 38°C 5h/day). Some isolates were more efficient in nitrogen translocation to the pods after the heat stress. There was no relation between the tolerance to this stress condition and the ability of the different groups of rhizobia to grow at high temperature in vitro, as well as between the temperature of the trap-host growth frem wich the isolate was recovered and efficiency under heat shock treatment.