Caracterização e análise funcional da comunidade bacteriana ruminal de caprinos da caatinga brasileira utilizando DNA metagenômico. - CUNHA, I. de S. da (2010)
Metagenoma refere-se à estrutura genética coletiva e funcional de uma comunidade microbiana. A riqueza e composição da comunidade microbiana do rúmen têm sido estudadas por técnicas de amplificação e sequenciamento dos genes que codificam o RNA ribossomal 16S/18S. Apesar dos inúmeros trabalhos sobre a microbiota de diferentes tipos de ruminantes, poucos estudos utilizaram técnicas moleculares independentes de cultivo para estudar o rúmen caprino. A clonagem e sequenciamento do gene 16S rRNA são considerados métodos eficientes para estudar a diversidade bacteriana em amostras naturais pois, permitem a determinação da riqueza bacteriana em diferentes ambientes e a identificação filogenética de organismos ainda não cultivados. A maior parte da digestão da dieta natural dos ruminantes é realizada no rúmen pela comunidade microbiana, por meio de enzimas hidrolíticas. Neste trabalho, a comunidade de bactérias presentes nas frações líquida e sólido-aderida do rúmen de caprinos da raça Moxotó foram caracterizadas através da construção e sequenciamento de clones de uma biblioteca 16S rDNA. Para a biblioteca 16S rDNA, aproximadamente 400 sequências não quiméricas e maiores que 400 pb foram obtidas para cada biblioteca. As curvas de rarefação para as bibliotecas 16S rDNA bacterianas atingiram um platô a nível de distância evolutiva de 15%, indicando que para este nível, o esforço amostral foi suficiente para cobrir a diversidade existente. Sequências de bactérias pertencentes aos filos Bacteroidetes, Firmicutes, TM7, Verrucomicrobia, Actinobacteria, Lentisphaerae e Proteobacteria foram identificadas, sendo que as classes dominantes foram Clostridia e Bacteroidia. Com esses resultados, pôde-se concluir que a comunidade microbiana do rúmen da raça Moxotó é similar à encontrada em outros ruminantes. Porém, encontrou-se diferença na riqueza entre as duas frações, demonstrando que a comunidade bacteriana aderida ao material vegetal e a encontrada na fração líquida ruminal são distintas. Para explorar o potencial metabólico desta comunidade, foi construída uma biblioteca metagenômica de expressão de pequenos insertos da fração sólido-aderida (com média de inserto de 5kb) com aproximadamente 50.000 clones. Para a validação desta biblioteca metagenômica foi feita uma biblioteca 16S rDNA a partir da biblioteca metagenômica já construída. Com o estudo da riqueza bacteriana pôde-se comprovar a presença de filos já esperados para o rúmen, com a predominância dos filos Bacteroidetes e Firmicutes. Com o intuito de comprovar o potencial metabólico da comunidade bacteriana presente no rúmen caprino, foi realizada a bioprospecção da biblioteca metagenômica para atividade amilolítica. De um total de 2.670 colônias pesquisadas, 11 clones com atividade amilolítica e com padrões de restrição enzimática do DNA plasmidial distintos foram identificados. Um destes clones com inserto de cerca de 5 kb foi escolhido para sequenciamento (Ra33). O inserto deste clone foi subclonado e seus fragmentos sequenciados por primer walking. Até o presente momento 74% do clone foi sequenciado. Com os resultados obtidos da validação e do potencial metabólico pôde-se concluir que a biblioteca gerada possui a riqueza de filo esperada para uma amostra ruminal demonstrando que a metodologia de extração utilizada foi satisfatória. A biblioteca metagenômica de pequenos insertos construída neste trabalho poderá ser utilizada para bioprospecção de genes com outras atividades de interesse biotecnológico, incluindo genes codificadores de antimicrobianos e outras atividades hidrolícas como lipases, proteases e celulases.