Otimização e validação do método de determinação do conteúdo de polissacarídeo na vacina Haemophilus influenzae b (conjugada) por cromatografia a líquido de alta eficiência por troca aniônica - Santos, Anelyse de Carvalho Lira (2013)
Haemophilus influenzae tipo b (Hib) é uma bactéria patogênica responsável por causar pneumonia e meningite, principalmente em crianças menores de cinco anos. A doença causada por Hib pode ser prevenida através da imunização da população com a vacina conjugada polissacarídeo-proteína, cuja eficácia depende do principal fator de virulência da bactéria: a cápsula polissacarídica. Assim, para garantir a imunogenicidade da vacina, é importante o controle do conteúdo de polissacarídeo presente no produto final. O objetivo deste trabalho foi otimizar e validar o método analítico, desenvolvido pelo Departamento de Controle de Qualidade de Bio-Manguinhos, de determinação do conteúdo de polissacarídeo na vacina conjugada de Hib, empregando a técnica de cromatografia a líquido de alta eficiência por troca aniônica com detecção amperométrica pulsada. O método cromatográfico foi otimizado quanto à retenção e resolução adequadas. A mudança na waveform de trabalho promoveu maior sensibilidade, reprodutibilidade e menos desgaste do eletrodo de trabalho. A alteração da composição da fase móvel permitiu boa separação, com alta sensibilidade, reduzindo o tempo de corrida de 17 para 12 minutos. O tempo necessário para o pré-tratamento das amostras (hidrólise alcalina) foi reduzido de 7 horas para 40 minutos. Os parâmetros cromatográficos estabelecidos na otimização do método foram: coluna analítica CarboPac PA10 (4 x 250 mm) precedida por pré-colunas AminoTrap (3 x 30 mm) e BorateTrap (4 x 50 mm), da Dionex Corporation Foi empregado um fluxo de 1 mL/min, com eluição isocrática. A fase móvel foi composta de solução de acetato de sódio 0,2 mmol/L e solução de hidróxido de sódio 0,7 mol/L. O volume de injeção foi de 50 \03BCL. Os parâmetros de adequação do sistema da nova metodologia estão em conformidade com os preconizados nos compêndios oficiais no que concerne à validação de metodologias analíticas. O método demonstrou boa seletividade, bem como apresentou linearidade ao longo do intervalo de medição estudado, com limites de detecção e quantificação iguais a, respectivamente, 0,56 \03BCg/mL e 1,66 \03BCg/mL. A precisão do método pode ser considerada satisfatória, em termos dos coeficientes de variação obtidos, inferiores a 5 %, conforme preconiza a ANVISA. Não foi evidenciada diferença significativa entre os resultados apresentados por analistas diferentes em dias diferentes. A recuperação média obtida foi de (100 ± 2) %, demonstrando que o método apresenta exatidão adequada. Com relação à robustez, foi constatada a susceptibilidade do método a variações no pH da fase móvel e ao tempo de hidrólise. A validação do método produziu dados adequados para garantir a confiabilidade dos resultados analíticos obtidos e para o emprego da metodologia proposta no controle de qualidade do produto final, realizado pelo Laboratório Físico-Químico, do Departamento de Controle de Qualidade de Bio-Manguinhos.