Análise de proteínas de ligação ao RNA com o domínio dedo de zinco ZFP29 e ZFPTTP em Trypanosoma cruzi - Romagnoli, Bruno Accioly Alves (2016)
A regulação da expressão gênica é essencial para que o Trypanosoma cruzi se adapte às diferentes condições impostas pelos seus hospedeiros durante seu ciclo de vida. Nos tripanossomatídeos esse controle é mediado principalmente por mecanismos pós-transcricionais, os quais atuam no metabolismo dos mRNAs e das proteínas. Nesse contexto, as proteínas de ligação ao RNA (RBPs) são componentes-chave, uma vez que interagem com os mRNAs durante todas as etapas de controle coordenando seus destinos na célula. São também capazes de se ligar a outras proteínas, formando complexos ribonucleoproteicos (mRNPs). Existem diferentes grupos de proteínas que compõem o repertório de RBPs no T. cruzi, entre elas as que apresentam o domínio dedo de zinco CCCH. Estudos anteriores com as proteínas ZFP29 e ZFPTTP s que apresentam esse domínio demonstraram que ambas têm sua expressão regulada ao longo do ciclo de vida do parasita, não sendo expressas nas formas tripomastigotas metacíclicas. Esse trabalho visou então analisar a regulação das proteínas ZFP29 e ZFPTTP na metaciclogênese e sua participação em complexos mRNPs. As proteínas ZFP29 e ZFPTTP são reguladas a partir das formas aderidas, tendo sido observado que ZFP29 não é detectada, enquanto na ZFPTTP a expressão é drasticamente reduzida. As proteínas ZFP29-FLAG e ZFPTTP-FLAG não apresentaram o mesmo controle observado para as proteínas nativas nas formas aderidas, no entanto, também foram reguladas negativamente no estágio metacíclico. Ao analisar a expressão dos mRNAs das proteínas ZFP29 e ZFPTTP por qPCR na metaciclogênese, foi observado que o transcrito de ZFPTTP é constantemente expresso, enquanto que o de ZFP29 foi reduzido apenas nas formas metacíclicas. Esses resultados indicam a possibilidade de haver diferentes mecanismos regulatórios atuando no nível de transcrito e/ou proteína para controlar a expressão de ZFP29 e ZFPTTP em diversos estágios da metaciclogênese. Essas duas proteínas são citoplasmáticas em epimastigotas e, enquanto ZFP29 mantém essa localização nos parasitas estressados, ZFPTTP aparenta localizar-se também no núcleo durante o estresse. Os parasitas expressando ZFP29-FLAG apresentaram alterações na diferenciação, mas não no crescimento. Já a expressão de ZFPTTP-FLAG provocou mudanças tanto na diferenciação quanto no crescimento. Ensaios de imunoprecipitação dos complexos mRNPs associados a ZFP29-FLAG e ZFPTTP-FLAG foram realizados em epimastigotas e nos parasitas submetidos ao estresse. No caso da proteína ZFP29-FLAG, foram encontrados mRNAs que codificam para proteínas de superfície, proteínas motoras e proteínas hipotéticas. A diferença entre as populações em epimastigotas e nos parasitas em estresse aponta que ZFP29 forma diferentes complexos mRNPs em cada uma dessas duas condições. Para a proteína ZFPTTP-FLAG mais de 40% dos transcritos codificam proteínas ribossomais, sugerindo uma função de ZFPTTP relacionada à tradução. Esse estudo reforça a teoria dos RNA regulons atuando no controle da expressão gênica em T. cruzi, aprofundando o conhecimento para a formação de redes de regulação pós-transcricionais nesse parasita.