Desenvolvimento de uma plataforma genética para superexpressão heteróloga em células CHO - Campos, Bruna Evelyn Rocha (2021)
Visando monitorar o comportamento celular durante a seleção, clonagem celular e análise de produtividade para elaboração de bancos de células altamente produtoras de proteínas recombinantes, foi desenvolvida uma plataforma de expressão heteróloga denominada Sistema Ingresso. Esse sistema se baseia em manipulação genética de células eucarióticas baseada em integração no genoma por transposase e seleção celular por marcador fluorescente, traduzido a partir de mRNA bicistrônico. A partir desse sistema, o objetivo deste trabalho foi realizar adaptações para aumentar os níveis de expressão do gene referente à proteína terapêutica de interesse Pró-Trombina de forma a otimizar o processo de produção, obtendo assim as versões Sistema Ingresso 1.0 e 2.0. Para isso, testes de quantificação da proteína terapêutica de interesse Pró-Trombina foram realizados na presença de uma sequência 5’UTR (populações e clones - Sistema Ingresso 1.0), uma sequência 3’UTR e enhancers de promotores (populações - Sistema Ingresso 2.0) em cultivo Fed-batch de células ExpiCHO. A presença da sequência 5’UTR resultou em aumento da expressão de Pró-Trombina em testes iniciais de expressão em populações obtidas por enriquecimento por cell sorting para o marcador de seleção. Essa sequência 5’UTR foi então utilizada para a análise de expressão de Pró-Trombina em clones submetidos a cultivo Fed-batch em erlenmeyers e em microbiorreatores Ambr15. Esta população proveniente do Sistema Ingresso 1.0 apresentou títulos de Pró-Trombina de 0,24g/L em cultivo Fed-batch em erlenmeyers. Nesse mesmo experimento foram identificados clones promissores que apresentaram níveis maiores de proteína no final do experimento: 0,40g/L, 0,35g/L e 0,33g/L para os clones #28, #4 e #15, respectivamente. Em cultivo Fed-batch em microbiorreator Ambr15 foi possível observar que ambos os clones #28 e #4 também se apresentaram promissores, apresentando viabilidade acima de 80% no final do experimento e títulos de 0,27g/L e 0,13g/L, respectivamente. Quando utilizada a sequência 3’UTR em conjunto com a sequência 5’UTR foi possível observar a tendência do aumento da expressão de Pró-trombina nas populações obtidas, possivelmente incrementada na presença de sequências de enhancers de promotores. Novos testes devem ser realizados para fins de cálculos estatísticos e validação dos resultados encontrados, além de análises de integração e genômica e novas adaptações como alterações em meios de cultivo para a continuação desse trabalho.