Expressão de calpaínas e efeito do inibidor MDL28170 em Leishmania braziliensis - Vitório, Bianca da Silva (2014)
As diversas espécies de Leishmania são parasitas de considerável importância médica e econômica. As drogas atualmente utilizadas no tratamento da leishmaniose apresentam efeitos adversos, alta toxicidade, elevado custo e surgimento de cepas resistentes. Nesse contexto, inibidores proteolíticos é uma alternativa para o tratamento desta doença. Este estudo está focado nas calpaínas, que compreendem uma família de cisteína peptidases neutras dependentes de cálcio, envolvidas numa ampla variedade de funções fisiológicas. As calpaínas estão envolvidas em importantes doenças humanas, portanto inibidores de calpaínas já vêm sendo desenvolvidos e testados para o tratamento dessas doenças, alguns encontra-se em estágios avançados de triagem clínica. Dessa forma, o presente trabalho avalia a expressão e identificação de homólogos das calpaínas em Leishmania braziliensis e o efeito do inibidor de calpaínas MDL28170 em ensaios in vitro. Através da busca por sequências no GenBank, alinhamentos múltiplos, filogenia e análise de domínios conservados nas sequências obtidas, selecionamos como alvo inicial sequências de calpaínas que possuíam o maior número de domínios conservados. A análise da expressão gênica relativa indica que 13 das 20 calpaínas estudadas apresentam níveis constitutivos de mRNA nas formas procíclica e metacíclica de L. braziliensis. A expressão de cinco alvos é maior na forma procíclica, e a de um alvo é maior na forma metacíclica e há expressão estágio específica de apenas um alvo na forma procíclica. A partir de análises in silico, das sequências proteicas dessas calpaínas, selecionamos uma região consenso e um peptídeo correspondente a essa região foi sintetizado e empregado na imunização de coelhos A reatividade do anticorpo gerado (Anti-TryTrip CALPAIN) foi avaliada por Western blotting, citometria de fluxo e imunocitoquímica. Em ensaios de Western blotting,verificamos que o anticorpo foi capaz de reagir contra uma proteína de 50 kDa. Já na imunolocalização foi possível observar calpaínas dispersas no citoplasma, membrana e núcleo. Além disso, através de citometria de fluxo, as moléculas homólogas às calpaínas foram identificadas em maior abundância no interior das células. Nos ensaios de inibição com o MDL28170, inibidor de calpaínas, foi possível observar a redução da proliferação nas formas promastigotas recém isoladas e múltiplas passagens de forma dose-dependente nas diferentes concentrações do inibidor ao longo de quatro dias. O efeito reversíveldo inibidor também foi avaliado nas formas promastigotas, com taxas menores comparado com o controle. O efeito do inibidor, também foi capaz de diminuir de maneira dose-dependente o índice de associação e aumentou o percentual de células com parasitos aderidos durante o processo de interação com macrófagos peritoneais. O parasito aumentou a expressão de uma peptidse clássica (gp63) quando tratado com o MDL28170, já a expressão de calpaínas e cpb não foi alterada pelo estresse induzido pelo composto. Estes dados sugerem mais estudos para melhor caracterizar as calpaínas em L. braziliensis e sugerem uma maior avaliação para uma possível associação de moléculas similares as calpaínas com a virulência ou não do parasito. Assim este trabalho acrescenta novas possibilidades para a utilização de inibidores de calpaínas como um potencial alvo de desenvolvimento para o tratamento da leishmaniose