Caracterização de componentes da via TOR (target of rapamycin) em Trypanosoma cruzi - Miot, Hálisson Tesseroli (2014)
Uma das vias de sinalização mais estudada nos últimos anos, é a via TOR (target of rapamycin), um importante sensor nutricional presente em eucariotos. O efeito da rapamicina é dependente de sua interação com a proteína FKBP12 que por sua vez, interage com a proteína TOR, impedindo o acesso da mesma aos seus substratos. Por meio de identificação in silico demonstramos a existência dos genes TOR1, TOR2, TOR-like1, TOR-like2, Raptor, AVO3, Raptor-like e FKBP12 em Trypanosoma cruzi. O tratamento das formas epimastigotas com rapamicina induziu expressiva alteração morfológica e redução da proliferação celular, corroborando a presença desta via no parasita. Os genes foram clonados, as proteínas foram expressas, purificadas e inoculadas em camundongos e coelhos para obtenção de anticorpos. Apenas o anticorpo para a proteína FKBP12 apresentou alta especificidade e foi demonstrado através de ensaio de imunofluorescência indireta que esta proteína localiza-se no núcleo, e confirmado através de western blot com extrato da fração nuclear do parasita. Através de ensaios de imunoprecipitação em parasitas não-tratados, tratados com rapamicina e parasitas submetidos a estresse nutricional e posterior análise por espectrometria de massas, identificamos os complexos proteicos que se associam com a proteína FKBP12. Proteínas como Hsp90, H2A, proteínas ribossomais e de ligação à RNA foram identificadas, demonstrando que a proteína FKBP12 está envolvida na biogênese de ribossomos, modificação da estrutura da cromatina e transporte de mRNA. Foi visto ainda que o processo de tradução parece estar sendo afetado após o tratamento com 5 μg/mL de rapamicina, pois houve uma redução de proteínas envolvidas com esse evento identificadas no experimento de imunoprecipitação. Foi realizado o knock-out de um alelo do gene da proteína FKBP12 e a sua confirmação ainda será realizada. O fracionamento dos extratos proteicos de parasitas em gradiente de sacarose mostraram a mobilização da proteína ribossomal S6 da fração polissomal para as frações leves, quando os parasitas foram tratados com rapamicina e submetidos a estresse nutricional. Este resultado sugere que nestas condições, a via TOR esteja inibida, e a proteína ribossomal S6, um dos alvos desta via, não está fosforilada, consequentemente, afetando o processo de tradução celular.