Teste de ativação de monócitos para detecção de pirogênios in vitro aplicado à vacina meningocócica C conjugada - Silva, Vítor Fernandes (2017)
A detecção de pirogênios em produtos parenterais é mandatória pelas agências reguladoras. Atualmente, para avaliar o conteúdo de pirogênios, as principais farmacopeias preconizam o teste de pirogênio em coelhos (RPT), o lisado de amebócito de Limulus (LAL) e o teste de ativação de monócitos (MAT). Este estudo teve como objetivo avaliar a aplicabilidade do MAT ao CQ da vacina Meningocócica C conjugada (MenCC) como alternativa ao uso de coelhos no teste de pirogenia in vivo, ampliar a detecção de potenciais fontes de pirogênios nãoendotoxina (NEPs), realizar análise comparativa entre os diferentes sistemas do MAT, comparando sistemas validados (ICCVAM 2008) com uma proposta original, sangue criopreservado/IL-6 e confrontar os dados dos três ensaios de detecção de pirogênios, RPT, LAL e MAT, aplicados a lotes da MenCC. Os sistemas do MAT combinaram a utilização de matrizes monocíticas (sangue total fresco e criopreservado) e a detecção de citocinas próinflamatórias (IL-6 e IL-1β) como parâmetros de leitura. Lipopolissacarídeo (LPS), ácido lipoteicóico (LTA) e zymozan A (ZA) foram utilizados como padrões moleculares associados à pirogenia de Gram-negativas, Gram-positivas e fungos, respectivamente. Foram avaliados 3 lotes de MenCC produzidos por Bio-Manguinhos. Estes foram incubados em contato com a matriz monocítica em estufa de CO2 a 37° C e após 16 horas foram quantificadas IL-1β e IL-6 pelo ensaio de ELISA (R&D Systems). Em paralelo, os lotes foram analisados frente aos métodos farmacopeicos clássicos de detecção de pirogênios, o LAL e o RPT. A validação produto específica, MenCC frente ao MAT não apresentou interferência, mostrando aplicabilidade do teste ao produto. Todas as diluições da vacina, bem como a presença do adjuvante não interferiram na detecção de IL-6 e IL-1β, induzidos pelo padrão exógeno de LPS. O sistema foi capaz de identificar NEPs (LTA e ZA) na presença de MenCC. Análises estatísticas demonstraram uma boa correlação entre os sistemas de leituras (IL-1β e IL-6) para curvas de LPS em NaCl (r=0,9918 e p=0,0001) e em MenCC (r=0,9702 e p=0,0028). Os ensaios de linhas paralelas das curvas de LPS e LTA em NaCl versus MenCC demonstraram que o pvalor para o não-paralelismo não foi significante para IL-1β e IL-6 (p > 0,05). Os ensaios quantitativos demonstraram que os 3 lotes foram considerados não pirogênicos, reforçando os resultados obtidos pelos métodos clássicos RPT e LAL. O presente estudo demonstrou a aplicabilidade do MAT para a MenCC, observando uma correlação positiva com os ensaios clássicos RPT e LAL, bem como a análise diferencial e quantitativa de NEPs, potenciais alvos de contaminação na indústria. Os resultados abrem uma avenida de oportunidades atendendo o recrutamento internacional de esforços para redução de animais, principalmente para fins industriais, dando início a uma missão preventiva às futuras regulamentações referentes ao uso de animais no Brasil.