Estudo de validação da metodologia qPCR para quantificação do vírus Zika e aplicação de métodos matemáticos para estimativa da sensibilidade analítica - Lima, Luiz Augusto Pinto (2020)
O diagnóstico rápido e o desenvolvimento de vacinas destacam-se como demandas prioritárias para o combate e prevenção de novas epidemias de doenças infecciosas. Neste contexto, a reação em cadeia da polimerase (PCR) permite o diagnóstico da doença com alta sensibilidade e especificidade, além de possibilitar o emprego de metodologias no controle de qualidade e em processos produtivos de vacinas virais. Considerando as fragilidades regulatórias para a validação deste tipo de metodologia como obstáculos para os profissionais da área de análises, esse estudo objetiva-se validar um método de PCR Tempo Real (qPCR) para quantificação de RNA do vírus Zika além da aplicação de quatro abordagens para estimar a sensibilidade analítica (LoD). Para tanto, a eficiência da extração do material genético e a especificidade analítica foram avaliadas mediante investigação de possíveis contaminações cruzadas e amplificações inespecíficas. A reprodutibilidade da curva padrão, a faixa linear, o limite de quantificação (LoQ) e a eficiência de amplificação também foram determinados. A exatidão e as características de precisão (repetibilidade e precisão intermediária) foram investigadas mediante a avaliação da recuperação do vírus alvo inoculado em amostras de soro humano e mediante aplicação do modelo de análise de variâncias (ANOVA). A sensibilidade analítica foi estimada por meio da aplicação do método empírico de diluições, do método de Finney e via aplicação das regressões logit e probit. Desse modo, observou-se que o procedimento de extração se mostrou robusto, mediante aprovação dos controles de extração e amplificação testados. Ademais, a metodologia demonstrou capacidade de detectar o vírus alvo inequivocamente, com ausência de sinais de fluorescência inespecíficos. A curva padrão apresentou reprodutibilidade, possibilitando a estimativa do LoQ como 100 cópias/\03BCL. A faixa linear foi determinada no intervalo 1,7706 - 7,2294 Log10cópias/\03BCL e a eficiência de amplificação média obtida foi 101,6%. Características de exatidão e precisão aceitáveis foram obtidas na faixa de concentração 2,69897 \2013 6,69897 Log10cópias/\03BCL. Os valores de LoD, individualmente estimados, foram 12,5 cópias/\03BCL (método de diluições), 18,89 cópias/\03BCL (método de Finney), 10,35 (probit) e 11,08 cópias/\03BCL (logit). Assim, os resultados permitiram concluir que a metodologia estudada foi considerada possuidora de aceitáveis parâmetros de desempenho, podendo encontrar aplicabilidade no diagnóstico em ensaios clínicos que, por ventura, possam ser executados durante as etapas de desenvolvimento de uma formulação vacinal para prevenção da infecção pelo vírus Zika.