Ensaio molecular para vigilância epidemiológica de gripe com ênfase no diagnóstico de Influenza A H1N1 - Dias, Ronaldo Ferreira (2011)
O uso de métodos moleculares tem sido apontado como uma das principais ferramentas para o diagnóstico de doenças infecciosas. Dentre as técnicas disponíveis, a PCR em tempo real tem sido uma das mais amplamente utilizadas. A partir dos achados das inúmeras pesquisas desenvolvidas em virtude da epidemia de Influenza A H1N1 em 2009, tal metodologia foi preconizada pelo CDC como sendo a mais eficiente para a confirmação desta patologia na população. A rápida disseminação da epidemia de 2009, em território Brasileiro, evidenciou a necessidade de adoção de uma alternativa de teste em âmbito nacional, cujos custos fossem mais compatíveis com os recursos de que dispõe o Sistema Único de Saúde (SUS). Esta dissertação buscou estabelecer um protótipo de produto para a Vigilância epidemiológica de Influenza A H1N1 a partir de uma plataforma de PCR em Tempo Real, visando contribuir para o estabelecimento de uma rede de vigilância epidemiológica baseada em ensaios moleculares, com a definição de uma matriz de extração semiautomatizada e um equipamento para a realização de PCR em Tempo Real. Este trabalho foi desenvolvido por meio da comparação de matrizes de extração e de equipamentos de PCR em tempo real dos principais fornecedores internacionais. A empresa que obteve a melhor avaliação segundo os critérios descritos foi a Biotools®, por ter apresentado uma proposta competitiva quanto aos custos das plataformas e insumos necessários, além de um atraente pacote de transferência de tecnologia. Após a definição dos equipamentos e insumos, foi iniciada a aferição de um protótipo de modelo nacionalizado de diagnóstico. Em paralelo, buscou-se ainda a melhoria do desempenho do modelo brasileiro, com a avaliação de diferentes composições da mistura de reação, tendo sido também testadas regiões genômicas diferentes daquelas do padrão de referência para o diagnóstico, além da possibilidade do uso de sondas purificadas. Com base nos resultados obtidos, observou-se que a extração semiautomatizada e aquela realizada pelo método manual apresentam um padrão semelhante de eficiência. Também foi comprovada a capacidade de extração do equipamento, inclusive em diluições de amostra pura até uma concentração de 1024 vezes, além da eficiência da purificação de sondas pela técnica de HPLC (High-performance liquid chromatography). Ficou evidenciada a equivalência da reação de PCR em tempo real desenvolvida pelo consórcio IBMP/Bio-Manguinhos quando comparada à reação de PCR em tempo real desenvolvida pelo CDC-EUA, considerado padrão de referência para o diagnóstico molecular de influenza A H1N1. Concomitantemente, o modelo de equipamentos da Biotools(Labturbo/Liongene) oferece, como vantagens, a possibilidade de eliminar a etapa manual de extração indicada pelo protocolo do CDC, e de agregar ao processo a realização de uma extração semiautomatizada, o que facilita a execução do protocolo e amplia o quantitativo de amostras que podem ser examinadas a cada ciclo de trabalho.