Caracterização de gene de quitinase de Lutzomyia longipalpis: descrição de processamento alternativo e busca por seqüência promotora - Farias, João Ramalho Ortigão (2009)
As leishmanioses são doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania transmitidos pela picada de flebotomíneos infectados. Os atuais métodos de combate a estas moléstias têm se mostrado ineficazes e maiores conhecimentos sobre a interação Leishmania-flebotomíneos são necessários para o desenvolvimento de novas formas de controle. Com o emprego da técnica de amostragem diferencial por RT-PCR (DDRT-PCR), foi encontrado anteriormente em nosso laboratório um cDNA codificante para uma quitinase intestino-específica de Lutzomyia longipalpis, nomeada LlChit1A. Foi visto que este produto do gene LlChit1 possui altos níveis de transcrição em fêmeas adultas 3 dias após a alimentação sangüínea, indicando um possível papel na degradação da matriz peritrófica (MP). Neste trabalho, um fragmento do LlChit1A foi usado para sondar uma biblioteca genômica de L. longipalpis, possibilitando o isolamento de um clone contendo o gene codificador desta enzima, que recebeu o nome LlChit1G. A amplificação por PCR e seqüenciamento deste gene revelaram a presença de 4 introns que interrompem a seqüência codificante para a LlChit1A. Foi visto por RT-PCR que o gene LlChit1 também está ativo em larvas, transcrevendo mais duas novas formas de splicing, nomeadas LlChit1B e LlChit1C. Estes dois novos transcritos possuem códons de parada, introduzidos a partir do quarto íntron, que interrompem a tradução do domínio de ligação à quitina codificado pelo último éxon. As possíveis novas enzimas codificadas devem atuar na digestão de alimentos ricos em quitina de maneira similar ao proposto para outras quitinases de inseto sem este domínio funcional. A região flanqueadora 5’ (RF5’) do clone genômico também foi amplificada por PCR e seqüenciada, evidenciando um possível promotor mínimo. Curiosamente, um gene ortólogo de Phlebotomus papatasi contém o começo da seqüência UTR 5` idêntica ao começo do RNAm da quitinase de L. longipalpis. Isso pode ser um indício de um possível sistema promotor conservado em flebotomíneos e com possível atuação na regulação da espessura da MP. Através da técnica de PCR invertido foi amplificada e seqüenciada uma região a montante do gene, não presente no LlChit1G. Análises de bioinformática indicaram a presença de um possível envolvimento de ecdisona no controle deste promotor. Através da anotação de ESTs codificantes para a seqüência completa ou parcial de proteínas similares a quitinases de L. longipalpis e P. papatasi foi possível identificar possíveis ortólogos de glicosideohidrolases da família 18. As seqüências primárias correspondentes ao domínio catalítilico encontrado nesta família foram comparadas por filogenia a seqüências já publicadas.