Obtenção, caracterização fisico-química e avaliação imunólogica de vacinas conjugadas de polissacarideo meningocócico sorogrupo C com toxóide tetânico - Silveira, Ivna Alana Freitas Brasileiro da (2007)
Neisseria meningitidis é um dos principais patógenos causadores de meningite e outras manifestações clínicas no mundo. O sorogrupo C é responsável por 40% dos casos de doença meningocócica no Brasil, constituindo um sério problema de Saúde Pública. As vacinas polissacarídicas disponíveis não induzem proteção e memória imunológica em lactentes, porque são antígenos T-independentes. Além disto, este polissacarídeo pode induzir tolerância imunológica após imunização repetida em crianças e adultos. Para a obtenção de um antígeno T-dependente, foram desenvolvidas todas as etapas de produção, purificação e controle de uma vacina conjugada brasileira efetiva, contra N.meningtidis sorogrupo C (MenPSC-TT), através de aminação redutiva modificada, utilizando como proteína carreadora, o toxóide tetânico ativado com hidrazida. Vários lotes de conjugados produzidos em diferentes escalas (200 a 20.000 doses humanas; 10µg/dose), sob condições reprodutíveis, apresentaram razões açúcar:proteína entre 0,3 e 0,5. Os resultados dos ensaios de controle de qualidade mostraram a eficiência do processo de purificação (sistema de ultrafiltração tangencial) na remoção de reagentes, sub-produtos de reação e polissacarídeo livre. Um lote piloto de vacina liofilizada apresentou resultados de controle de qualidade satisfatórios, incluindo segurança e estabilidade por mais de 2 anos após envase e liofilização. A vacina piloto foi imunogênica em camundongos de forma dose-dependente, com um aumento de 10 a 20 vezes nos títulos de IgG, principalmente das sub-classes IgG1 e IgG2b (títulos mais altos após a 1a dose; ANOVA, p<0,05) e sem a detecção de IgG2a. Estes anticorpos apresentaram títulos altos de atividade bactericida (SBA), correlacionáveis com proteção à doença meningocócica. A vacina induziu anticorpos com maiores índices de avidez nas concentrações de 0,1 e 1µg, sugerindo indução de memória imunológica. Foi encontrada uma alta correlação entre ELISA e atividade bactericida do soro (r = 0,91), enquanto a correlação entre ELISA de alta avidez e SBA foi mais baixa (r = 0,70). Camundongos imunizados em esquema primário com 2 ou 3 doses da vacina conjugada MenPSC-TT (grupo 1) e MenPSC nativo (grupo 2) receberam dose reforço com o conjugado, para a análise de resposta de memória. Nas amostras de soro do grupo 1 imunizados com 2 ou 3 doses foram detectados títulos de IgG mais elevados, principalmente do isotipo IgG1, sugerindo o reconhecimento do polissacarídeo nativo através da ativação de células B de memória. Além disto, a vacina conjugada induziu anticorpos antiTT capazes de proteger camundongos contra o desafio com toxina tetânica in vivo. Camundongos inoculados com diferentes lotes de conjugados sobreviveram ao desafio com uma cepa heteróloga sorogrupo C, apresentando mais que 85% de proteção, enquanto apenas 20% dos animais imunizados com MenPSC nativo sobreviveram. Estes resultados sugerem a manutenção de resposta humoral ao imunógeno durante um ano. A vacina também foi estudada para avaliação de células secretoras de anticorpos específicas do antígeno de curta e longa duração no baço e medula óssea, 1 ano após imunização primária. A resposta observada para o grupo imunizado com MenPSC-TT foi maior do que àquela induzida pelo MenPSC nativo, no baço (2.900 vs 450 por 1 x 10 7 células) e medula (6.850 vs 567 por 1 x 10 7 células; p<0.05). A produção de citocinas intracelular (IL-4, IL-10, IL-12, IFN-γ) analisada por citometria de fluxo não mostrou diferença significativa entre camundongos imunizados e grupos controle. O mesmo aconteceu quando o imunofenotipo de células T (CD4, CD8, CD69 and CD44) foi analisado. Entretanto, uma população de célula linfóide de memória (CD27+IgD-) foi detectada, em animais imunizados com 3 doses de MenPSC-TT, e desafiados com uma cepa heteróloga. Estes resultados demonstram a imunogenicidade e segurança da vacina conjugada MenPSC-TT e sustentam a produção de lotes vacinais em condições de Boas Práticas de Fabricação para a realização de estudos clínicos de Fase I.