Caracterização da histona desacetilase 2 (TgHDAC2) de Toxoplasma gondii - Siqueira, Caroline de Moraes de (2018)
A desacetilação de histonas é uma forma de regulação epigenética que está associada ao silenciamento gênico, uma vez que a remoção de grupos acetil por histona desacetilases (HDACs) resultam em uma cromatina mais condensada. Em Toxoplasma gondii (T. gondii) pouco se sabe sobre estas enzimas, mas acredita-se que elas são uma parte essencial da regulação da expressão gênica. T. gondii possui 7 HDACs, incluindo TgHDAC2, o objeto do nosso estudo. Embora seja considerada uma HDAC clássica de classe I, muito semelhante a outros eucariotos, a TgHDAC2 possui duas inserções aminoacídicas dentro do domínio HDAC característico, algo exclusivo de alguns membros do filo Apicomplexa, e cuja função permanece desconhecida. Além disso, resultados de RNA-seq depositados na base de dados de T. gondii mostram um aumento da expressão de TgHDAC2 durante a fase S do ciclo celular. Para caracterizá-la, obtivemos o nocaute de tghdac2, o qual foi substituído pelo gene hxgprt através de recombinação homóloga. Até o momento, observamos menor infectividade e taxa de proliferação de parasitas Δtghdac2, sugerindo um papel durante a progressão do ciclo celular, possivelmente durante a fase S. Também notamos que os parasitas Δtghdac2 se apresentavam desorganizados no vacúolo parasitóforo, possivelmente devido a defeitos no ciclo celular. Para confirmar estas hipóteses, foi feita uma análise de ciclo celular por citometria de fluxo, onde observamos enriquecimento de parasitas nocaute na fase S do ciclo celular, além de maior taxa de incorporação de EdU evidenciando algum defeito ou atraso nesta fase. Com o objetivo de analisar o nível de acetilação de histonas conservadas nos parasitas Δtghdac2, foram feitos ensaios de Western blot para histonas H3 e H4 acetiladas, porém não mostraram diferenças estatísticas nos níveis de acetilação na ausência de TgHDAC2, indicando que ela não é responsável por desacetilar estas histonas. Contudo, não podemos descartar que a TgHDAC2 possa ter outras histonas como alvo ou ainda outros substratos. Além disso, dados de dicroísmo circular foram realizados a fim de desvendar a estrutura secundária das inserções aminoacídicas presentes no domínio HDAC, e indicaram que ela é uma proteína enovelada, monomérica e estável até em altas temperaturas. O etiquetamento da proteína endógena não obteve sucesso, não sendo possível a detecção por Westen Blot ou imunofluorescência. Entretanto, a superexpressão de TgHDAC2 mostrou uma localização celular nuclear em ensaios de imunofluorescência, contudo a fusão com a etiqueta de GFP não pode ser detectada por Western Blot. Apesar da necessidade de mais experimentos, nossos dados sugerem uma função na progressão do ciclo celular possivelmente na replicação do DNA.