Avaliação de biomarcadores da resposta imune celular e humoral na tuberculose pleural - Silva, Renan Jeremias da (2019)
A TB pleural (TBpl) é a principal causa de derrame pleural em nosso meio. Os métodos microbiológicos tradicionais, a histopatologia, teste diagnóstico padrão, e a dosagem da adenosina deaminase (ADA) apresentam limitações. Assim, há uma forte demanda por métodos mais simples, rápidos e acurados, bem como a busca por novos marcadores de TB, que auxiliem o diagnóstico da doença. Assim, avaliamos a resposta imune celular e humoral a novos antígenos (Ag) específicos de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) em pacientes com TBpl, investigando possíveis biomarcadores da doença que possam auxiliar no diagnóstico. Detectamos, por ensaio imunoenzimático (ELISA) in house, anticorpos IgA e IgG aos antígenos de Mtb, MT10.3, MPT64, PPE59, fusão MPT64:MT10 e a quimera proteica F2, paralelamente, em soros e FP, e a produção citocinas Th1/Th2/Th17 por ensaio CBA, no sobrenadande de cultura de células do FP (PFMC) e sangue periférico (PBMC), estimulados com os antígenos ESAT-6/CFP-10 e PstS1(285-374)/CFP-10, em pacientes adultos com TBpl e com outras pleurisias não tuberculosas (OPL). Oferecemos prova de conceito da aplicabilidade do MT10.3:MPT64 na detecção de Ac por técnica rápida de imunodot. ELISA e dot-ELISA IgA e IgG foram avaliados em amostras pareadas de pacientes com TBpl (n=29) e com OPL (n=39). No ELISA, a imunodominância de IgA-MT10.3:MPT64 no FP foi confirmada em TBpl (86,2%), seguida por PPE59 (62%) e da F2 (51,7%). A IgG-MT10.3:MPT64 no FP e soro exibiu a sensibilidade de 65,5% e 51,7%, respectivamente. Ambos com especificidade de 95% Os resultados dos testes combinados apresentaram sensibilidade para IgA-MT10.3:MPT64/-PPE59 no FP (93,1%) e IgA/IgG-MT10.3:MPT64 (92,3%), seguido por IgA-MT10.3: MPT64/-MPT64 ou /-F2 (89,6%) com especificidade (94,9%). Os resultados combinados da ADA e IgA-MT10.3:MPT64/-F2 no FP demonstraram maior sensibilidade (96,6%), e especificidade de 92,3%. O teste rápido, simples e de baixo custo, baseado no dot-ELISA-MT10:MPT64 para detecção de IgA em FP e IgG em soro foi capaz de caracterizar a imunoreatividade dos antígenos em pacientes TBPL, podendo ser adaptado para um teste tipo \201Cpoint-of-care\201D (POC). Na resposta imune celular, PstS1(285-374):CFP10 apresentou performance comparável ao ESAT-6:CFP-10, porém com aumento significativo na produção de IFN-y por PFMC em TBpl comparado aos OPL, bem como, em relação às PBMC. Produção de IL-10 por PFMC foi significativamente aumentada na TBpl para o ESAT-6:CFP-10 em relação às PBMC, mas não versus controle. As IL-2, IL-6, TNF e IL-17A apresentaram tendência ao aumento em culturas de PFMC, mas sem diferença significativa. O ELISA aqui desenvolvido para a detecção de IgA e IgG, utilizando diferentes marcadores, mostra o potencial desta ferramenta para auxiliar no diagnóstico da TBpl, bem como, pela primeira vez o desenvolvimento de um teste rápido e simples baseado no dot-ELISA-MT10.3:MPT-64. A proteína de fusão MT10:MPT64 se confirmou altamente promissora na detecção de biomarcador IgA em FP, e IgG sérica, que embora com menor sensibilidade tem potencial além dos testes microbiológicos. Combinando os resultados dos testes com a ADA há aumento no potencial diagnóstico. PstS1(285-374):CFP10 mostrou performance similiar ao ESAT-6:CFP-10, com aumento significativo na produção de IFN-y em PFMC na TBpl, mais estudos são necessários para corroborar este dado.