Caracterização de genes regulados pelas vias das MAP quinases e triagem de inibidores para o desenvolvimento de novos fármacos contra o Schistosoma mansoni - Batista, Izabella Cristina Andrade (2020)
Schistosoma mansoni utiliza sinais extracelulares específicos para gerar respostas celulares apropriadas para se desenvolver e sobreviver no corpo do seu hospedeiro. Nesse contexto, a transdução de sinal envolvendo proteínas quinases eucarióticas (ePKs) tem papéis essenciais em mecanismos reguladores. Recentemente, nosso grupo mostrou que as Proteínas Quinases Ativadas por Mitógenos (MAPKs), como SmERK1, SmERK2, Smp38 e SmJNK, estão envolvidas na reprodução/oviposição, sobrevivência e desenvolvimento do parasito, indicando que essas MAPKs podem ser alvos promissores para o desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento da esquistossomose. Dados de RNASeq também demonstraram que as vias de Smp38 e SmJNK regulam a expressão de um grande conjunto de genes, dentre eles dois genes importantes para o ciclo de vida do parasito: (1) proteína de ligação ao RNAm do inibidor do ativador do plasminogênio 1 (SmPAI-RBP1), responsável pela estabilidade/regulação do PAI-1, que funciona como o principal inibidor do ativador do plasminogênio tecidual (tPA) e da uroquinase (uPA) e, portanto, da fibrinólise; e (2) hipoxantina-guanina fosforibosiltransferases (SmHGPRTases), uma família de enzimas chave (codificada por cinco genes diferentes) para via de salvação de purinas, uma vez que o parasito não tem a capacidade de realizar a síntese de novo de purinas. Dessa forma, este trabalho procurou identificar compostos ativos e específicos para as MAPKs de S. mansoni e caracterizar SmPAI-RBP1 e SmHGPRTases, pois esses dois genes poderiam ser alvos de drogas mais específicos contra a esquistossomose. Primeiramente, para verificar a atividade das PKs e, posteriormente, realizar a triagem de moléculas usando inibidores das mesmas, as proteínas SmERK1, SmERK2 e SmJNK foram expressas para validar um ensaio de atividade protéica com base na investigação do sítio de ligação ao ATP usando a detecção de polarização da fluorescência através do uso de uma sonda denominada BODIPY® FL ATP-γ-S. Como alternativa a este teste, também realizamos uma triagem in silico para priorização de moléculas disponíveis na Managed Chemical Compound Collection (MCCC) por “docking” para predizer ligações das moléculas ao sítio de ligação ao ATP de cada PK do S. mansoni e dos ortólogos correspondentes em humanos para posterior teste in vitro. Além disso, os papéis funcionais de SmHGPRTases e SmPAI-RBP1 foram caracterizados usando RNA de interferência e quantificação da atividade de proteínas. Neste trabalho, conseguimos expressar todas as PKs e purificar SmJNK e SmERK1. Também desenvolvemos um ensaio baseado em polarização de fluorescência da luz para verificar a capacidade de ligação das PKs ao ATP e validamos a triagem como um método “high-throughput” usando moléculas preditas em se ligar ao sítio de ligação ao ATP da PKA. Além disso, a priorização de compostos usando o “docking” in silico provou ser uma ferramenta muito útil. De 80.000 moléculas do MCCC, 140 foram selecionadas, dentre essas, 61 foram ativas, sendo nove para SmERK1, uma para SmERK2, doze para Smp38, cinco para JNK e 36 para todas as PKs. Além disso, usando inibidores preditos para Smp38 e SmJNK, confirmamos experimentalmente que a via Smp38 regula SmHGPRTase 1, SmHGPRTase 3 e SmPAI-RBP1 e a via SmJNK regula SmPAI-RBP1. Nossos resultados também sugerem que a atividade de SmHGPRTases tem um papel essencial no desenvolvimento de esporocistos e esquistossômulos, uma vez que diferenças significativas na viabilidade, tamanho e/ou forma foram observadas após silenciamento in vitro. Além disso, o silenciamento de SmHGPRTases influenciou o desenvolvimento do ovário e a maturação dos ovos em fêmeas recuperadas de infecções em mamíferos, promovendo também alterações de movimento nos vermes silenciados in vitro. Além disso, o SmPAI-RBP1 pode estar envolvido no desenvolvimento de esporocistos e esquistossômulos, e também pode estar relacionado a danos no tegumento em machos nos quais a altura dos tubérculos foi reduzida. Concluindo, este estudo forneceu ferramentas úteis para descoberta de possíveis novos fármacos tendo como alvos PKs de S. mansoni e de outros organismos identificando um grande número de moléculas ativas para diferentes estágios de vida do S. mansoni e também contribuiu para elucidar os papéis funcionais de genes essenciais para o ciclo de vida do S. mansoni.