Aplicabilidade da técnica de PCR em tempo real para caracterização de espécies de Leishmania - Morais, Rayana Carla Silva de (2015)
A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é causada por protozoários, do gênero Leishmania, envolvidos em um complexo ciclo biológico. No Brasil, sete espécies estão envolvidas com a etiologia da doença, distribuídas em todas as regiões geográficas e responsáveis por diferentes manifestações clínicas. Diante disso, o diagnóstico em conjunto com a identificação da espécie é de grande importância clínico-terapêutica. Este trabalho tem por objetivo avaliar a aplicabilidade da técnica de PCR quantitativa em tempo real (qPCR) para identificação de espécies de Leishmania envolvidas com a etiologia da LTA. Foram realizados ensaios de qPCR para padronização da Temperatura de melting (Tm) utilizando cepas de referência de diferentes espécies de Leishmania. Após o diagnóstico em amostras de sangue de animais domésticos utilizando a qPCR, as amostras positivas foram analisadas através de suas Tm, e os produtos de qPCR foram purificados e sequenciados. Dez amostras previamente caracterizadas por isoenzimas, também foram analisadas através da Tm. Ainda como teste de referência, foi padronizada uma Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) utilizando as cepas de referência e testada nas amostras. Através da padronização da Tm das espécies, foram criados dois intervalos de análise: 1 (Tm = 78-79,99°C), que compreende: Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (V.) panamensis, Leishmania (V.) lainsoni, Leishmania (V.) guyanensis e Leishmania (V.) shawi; e 2 (Tm = 80-82,2°C), que compreende: Leishmania (V.) naiffi, Leishmania (L.) amazonensis e Leishmania (L.) mexicana. Um total de 223 amostras positivas foi analisado, destas, 58 incluídas no intervalo 1 e 165 no intervalo 2. O sequencimento de 94 destas amostras foi correspondente à L. (V.) braziliensis, L. (V.) panamensis e L. (V.) guyanensis. A RFLP em 173 amostras identificou 167 L. (V.) braziliensis, 05 L. (L.) mexicana e 01 L. (V.) panamensis. A análise da Tm das dez amostras caracterizadas por isoenzimas demonstrou 80% de concordância (p = 0,6499) entre o padrão-ouro (isoenzimas) e os intervalos desenvolvidos neste estudo. Os resultados do sequenciamento foram concordantes com a qPCR em 43,62% (n= 41) das amostras. A RFLP e qPCR tiveram 27,74% (n= 48) de concordância. Análise estatística mostrou que a qPCR e sequenciamento são testes sem diferenças estatísticas significantes (p = 0,2566). Sendo assim, é possível concluir que a Tm da qPCR pode ser utilizada como um método para direcionamento da espécie de Leishmania presente na amostra em análise, sendo necessário a realização de métodos clássicos de caracterização, quando a precisão na identificação do parasito for crucial para implementação do tratamento, como em casos de resistência e/ou recidiva da doença. A utilização desta tecnologia pode ser ainda mais precisa quando for utilizada a metodologia com sondas desenhadas para cada espécie de Leishmania, sendo necessários estudos futuros para comprovar esta perspectiva.