Análise da expressão de proteínas de ligação à heparina em tripomastigotas de Trypanosoma cruzi e seu papel como mediadoras da invasão na célula hospedeira - Tucci, Amanda Resende (2015)
A diversidade genética do Trypanosoma cruzi influencia diferentes parâmetros biológicos e tem sido apontada como fator importante para o desfecho clínico da doença de Chagas. A expressão diferencial de genes e proteínas entre as diferentes DTUs do T. cruzi parece determinar a virulência do parasito e sua capacidade de subverter a resposta imune e persistir no hospedeiro mamífero. Dentre o repertório de moléculas de superfície dos parasitos envolvido no reconhecimento celular, destacamos as proteínas de ligação à heparina (PLHs) que atuam no ciclo de vida de diferentes patógenos intracelulares, incluindo o T. cruzi. PLHs desempenham importante papel na citoaderência e entrada do T. cruzi através do reconhecimento de proteoglicanos de heparam sulfato (PGHS) na superfície de células de mamíferos. O mecanismo de invasão disparado pela interação PLHs-PGHS, assim como a presença de PLHs em T. cruzi de diferentes genótipos (TCI e TCII) ainda não foi elucidado. O presente estudo teve como objetivo avaliar a expressão de PLHs e glicoproteínas (GPs), gp35/50, gp82 e gp90, envolvidas na invasão de tripomastigotas derivados de cultivo celular (TCT), tripomastigotas sanguíneos (BT) e metacíclicos (MT) de T. cruzi da cepa Y (TcII) e isolado silvestre SMM36 (isolado de espécimes de Triatoma vitticeps da região de Santa Maria Madalena, RJ; Zimodema 3), bem como sua atuação nos eventos de internalização destes parasitos. A expressão e localização subcelular de PLHs e GPs em T. cruzi foi determinada pela incubação por 1h no gelo de tripomastigotas com 20\03BCg/mL de heparina ou heparam sulfato (HS) conjugados à biotina seguido de processamento para citometria de fluxo e microscopia de fluorescência As análises de citometria de fluxo revelaram que tripomastigotas (TCT, BT e MT) de diferentes genótipos (cepa Y e isolado SMM36) possuem uma expressão diferencial de PLHs e GPs em sua superfície. TCTs e BT (cepa Y) possuem elevada expressão de PLHs comparado aos MTs. Cerca de 90% da população de TCTs apresentam marcação positiva para PLHs enquanto apenas 10-25% dos MTs possuem esta proteína expressa na superfície. Em contraste, MTs apresentam níveis mais elevados de gp35/50, gp82 e gp90 comparados aos TCTs. A localização subcelular de PLHs em domínios de sinalização do T. cruzi é bastante peculiar. Em TCTs e BT (cepa Y), PLHs estão localizadas na membrana flagelar enquanto as GPs estão distribuídas ao longo do corpo do parasito (TCT e MT), exceto gp90 que é negativa nos TCTs. Ainda, a capacidade invasiva dos parasitos e o papel de proteoglicanos sulfatados foi analisada utilizando células de ovário de hamster chinês competentes (CHO-K1) e mutantes deficientes em glicosaminoglicanos (CHO-745) como modelo experimental de invasão. Os dados quantitativos da infecção revelaram que TCTs (cepa Y e isolado SMM36) são mais infectivos que MTs. TCTs alcançaram um perfil de infecção entre 52-85% após 2h de interação com CHO-K1, de acordo com a razão parasito-célula alvo, enquanto MTs atingiram o máximo de 6% de infecção neste tempo de interação Embora o percentual de infecção tenha sido similar entre TCTs dos diferentes genótipos, a análise do índice endocítico revelou maior eficiência do isolado SMM36 na invasão, apresentando valores cerca de 40% maior de parasitos interiorizados. Ainda, CHO-745 infectadas com TCT (Y e SMM36) apresentaram redução de aproximadamente 30% nos níveis de infecção quando comparadas a CHO-K1. Este fenômeno não foi observado em MTs mesmo após 24h de interação, cujo percentual de infecção alcançou 37% na maior relação parasito-célula alvo (60:1). Este conjunto de dados sugere que a interação PLHs-PGHS possa disparar vias de sinalização importantes para entrada de parasitos que expressam elevados níveis de PLHs em sua superfície. O mecanismo de invasão mediado pela interação PLHs-PGHS será alvo de futura investigação