Uso de PCR no diagnóstico da leishmaniose visceral canina: uma abordagem comparativa de diferentes protocolos e tecidos - Solcà, Manuela da Silva (2012)
No Brasil, os cães são considerados como o principal reservatório doméstico para Leishmania infantum (sin. L. chagasi). Desta forma, o diagnóstico da leishmaniose visceral canina (LVC) deve ser rápido e preciso. Este trabalho visa comparar a performance da reação em cadeia da polimerase (PCR) em detectar o DNA do parasito em diferentes tecidos para diagnóstico da LVC. Com este intuito, na primeira parte do estudo, foi padronizado um protocolo de PCR convencional (cPCR), para detecção do DNA do minicírculo do cinetoplasto (kDNA) de Leishmania sp., em 45 fragmentos esplênicos caninos. As mesmas amostras foram avaliadas utilizando-se um protocolo de PCR quantitativa (qPCR) tendo como alvo o gene da subunidade do RNA ribossomal (SSU rRNA) de Leishmania sp. Também foi comparada a eficácia do diagnóstico para LVC pelas técnicas moleculares e convencionais como a cultura e o ELISA. A cPCR apresentou sensibilidade mais elevada para detecção de DNA de Leishmania sp. (88,9%), comparada à qPCR (83,3%). Possivelmente o melhor desempenho da cPCR foi devido ao maior números de cópias do kDNA no genoma da Leishmania sp. Diante dos promissores resultados apresentados pela cPCR tendo o kDNA como alvo, na segunda parte do estudo foi padronizado um novo protocolo de qPCR com este mesmo alvo, objetivando-se aumentar a sensibilidade da técnica. Foram selecionados aleatoriamente 61 cães errantes e classificados de acordo com o número de sinais clínicos associados à LVC apresentados. Todos os cães foram eutanasiados, e durante a necropsia, foram coletados fragmentos de linfonodo, aspirado esplênico, medula óssea e sangue. Também foram realizadas culturas esplênicas e ELISA. A qPCR foi empregada para a avalição da taxa de detecção do DNA do parasito e carga parasitária nos diferentes tecidos. As diferenças entre a carga parasitária de cada tecido foram avaliadas pelo teste de Friedman (p ≤ 0,05). Para inclusão dos tecidos nas análises dos resultados de qPCR, foi avaliada a integridade do material genético de cada amostra. Desta forma, 52 animais apresentaram resultados que atendiam aos critérios de seleção para baço, sangue e linfonodo, e destes, 24 animais também atendiam aos critérios para medula óssea. Utilizando-se a qPCR e considerando pelo menos um dos tecidos avaliados, foi detectado o DNA do parasito em todos os cães. A qPCR detectou DNA do parasito em 98,1% dos aspirados esplênicos, 80,8% das amostras sanguíneas, 53,8% dos linfonodos e 41,7% dos aspirados de medula óssea. A carga parasitária foi melhor detectada nos aspirados esplênicos, em relação ao linfonodo, nos animais oligossintomáticos e polissintomáticos (p ≤ 0,05). O aspirado esplênico foi o tecido com maior taxa de detecção do DNA de Leishmania sp. pela qPCR. No entanto, não foi achada diferença estatística entre a carga parasitária do aspirado esplênico e do sangue. Desta forma, a amostra sanguínea, por ser a segunda amostra de melhor taxa de detecção, e por necessitar uma coleta menos invasiva, foi considerada como uma amostra alternativa válida para a detecção do DNA de Leishmania sp. em cães sintomáticos, utilizando a qPCR.