Padronização e validação do teste de neutralização por redução de placas de Lise em placa de 96 poços para avaliar a imunogenicidade do componente caxumba da vacina MMR - Miranda, Emily Hime (2015)
A caxumba é uma doença infecto-contagiosa imunoprevinível por vacinação. A imunogenicidade vacinal é avaliada através de testes sorológicos que detectam anticorpos neutralizantes, que são considerados correlatos de proteção. O Teste de Neutralização (PRNT) apresenta vantagens frente a outros testes por ser mais específico na detecção desses anticorpos neutralizantes. O presente estudo visou padronizar e validar a técnica. Durante a padronização foram definidos o M.O.I de 0,001 e o melhor dia de pico de vírus infeciosos (3 dias), para definir um protocolo de produção viral. A partir do vírus produzido foram avaliados qualitativamente o fenótipo da placa de lise e a diluição viral em diferentes condições analíticas. Os seguintes parâmetros foram definidos: diluição viral de 1:1600 para obter 30 placas de lise/poço, bicarbonato de sódio como tampão no meio de cultura, meio semi-sólido com carboximetilcelulose (CMC) 1,5%, tempo de adsorção de 3 horas e tempo de incubação final de 4 dias. Para avaliar o impacto do tempo de neutralização na potência viral e no de título de anticorpos neutralizantes, dois intervalos de tempo (1 e 2 horas) foram testados e a neutralização por 2 horas se demonstrou mais adequada ao ensaio. Posteriormente, foi definido um ponto de corte de 23, utilizando um painel sorológico contendo 126 soros pré e pós-vacinais de crianças imunizadas com a vacina tríplice viral. O ponto de corte foi determinado como a área sob a curva ROC usando os resultados de ELISA previamente avaliados em comparados com os resultados de PRNT. Dentre os resultados analisados, 35% foram concordantes na positividade dos resultados em ambos os testes. Valores preditivos positivos de 95,373 e valores negativos 97,680 determinam a real presença ou não da doença. Critérios de aceitação para o teste foram estabelecidos como: faixas de variação do end point do vírus (13 a 22) e faixas de variação dos controles (baixo, médio e alto). Também foi estabelecido como as amostras indeterminadas devem ser tratadas. Posteriormente, o PRNT foi submetido ao processo de validação, avaliando os parâmetros de linearidade, especificidade, exatidão e precisão, conforme preconizado pela RDC 27 da ANVISA. Nas análises de precisão foram obtidos coeficientes de variação a 15% para o limite inferior de quantificação do método (LIQ) e 20% para as demais concentrações. O mesmo ocorreu nas análises de exatidão. Quanto a seletividade, não foi detectada reação cruzada nas amostras quando desafiadas com o vírus de sarampo.