Análise da regulação da expressão gênica em células-tronco obtidas de tecido adiposo humano durante a diferenciação adipogênica e osteogênica e estudo do papel da helicase DDX6 neste processo - Marcon, Bruna Hilzendeger (2019)
As células-tronco obtidas de tecido adiposo humano (hASCs) são consideradas uma alternativa interessante para uso na medicina regenerativa e a compreensão de como se dá o balanço entre a manutenção de seu estado indiferenciado e o início da diferenciação é um passo importante para melhor aproveitar seu potencial. Dentre os mecanismos envolvidos neste processo, está a regulação do ciclo de vida dos transcritos, que envolve a ação de proteínas de ligação ao RNA, como a helicase DDX6. Em uma tese de Doutorado desenvolvida previamente em nosso grupo, observou-se que a redução da expressão desta proteína em hASCs (através do uso de RNAi) levou à aceleração da diferenciação adipogênica, com um maior acúmulo de lipídeos. Assim, o objetivo deste trabalho foi analisar a regulação da expressão gênica em hASCs durante as primeiras 24 horas de diferenciação adipogênica e osteogênica e avaliar o papel da helicase DDX6 neste processo. Para isso, foi primeiramente realizado o sequenciamento do RNAm total e das frações associadas a monossomos e polissomos de hASCs mantidas em meio não-indutor ou tratadas com meio de indução adipogênica ou osteogênica por 24 horas. A análise dos dados revelou que, em ambos os processos de diferenciação, houve uma importante regulação da expressão, sendo que na osteogênese houve um predomínio de genes regulados positivamente, enquanto que na adipogênese a maior parte dos genes diferencialmente expresso teve regulação negativa. Também se observou que, após 24 horas de indução adipogênica, já foi possível verificar mudanças na expressão de genes relacionados com a diferenciação, o que não ocorreu na osteogênese, sugerindo que o comprometimento com a diferenciação é mais precoce na adipogênese em hASCs. Além disso, após 24 horas de indução adipogênica, houve redução da atividade proliferativa nas hASCs, as quais apresentaram uma parada do ciclo celular em G1. Os resultados obtidos sugerem que este processo é independente de DEPTOR (inibidor da via mTOR, a qual é conhecida por regular processos como proliferação), estando majoritariamente relacionado a uma redução na abundância de transcritos de ciclo celular e proliferação. Em uma segunda etapa do trabalho, foi avaliado o papel da DDX6 em hASCs. Observou-se que hASCs expressam DDX6, a qual se encontrou dispersa no citoplasma, também se concentrando em estruturas granulares, as quais tiveram um comportamento semelhante a P-bodies: a manutenção de sua estrutura depende de RNA, apresentam colocalização parcial com Dcp1a e aumentam de número após tratamento com um análogo de puromicina. Através da análise por gradiente de sacarose, observou-se que, em hASCs, DDX6 comigrou majoritariamente com a fração livre, mas foi também identificada na fração de monossomos/polissomos leves. Porém, quando foi feita indução para diferenciação, houve mudança no padrão de sedimentação. Através de análise por imunofluorescência e por coimunoprecipitação, observou-se que DDX6 associa-se a diferentes moléculas que regulam o ciclo de vida do RNAm em hASCs e têm seu padrão de distribuição alterado durante o início da adipogênese e da osteogênese, o que pode estar relacionado às mudanças no comportamento do ciclo celular e da regulação da expressão gênica observadas durante o início do processo de diferenciação. A análise complementar do conteúdo de RNAm que se associa aos complexos contendo DDX6 nestas diferentes condições poderá trazer mais informações sobre o possível papel desta helicase na regulação da expressão gênica durante o início da diferenciação em hASCs. Desta forma, os resultados obtidos podem auxiliar na compreensão de como a manutenção do estado indiferenciado de hASCs é regulada e dos mecanismos que ocorrem nas primeiras etapas da diferenciação adipogênica e osteogênica.