Desenvolvimento e aplicação de marcadores moleculares para estudos taxonômicos, genéticos e epidemiológicos em Leishmania (Viannia) - Boité, Mariana Côrtes (2014)
As leishmanioses englobam um largo espectro de doenças causadas pelo parasita do gênero Leishmania. É notável o número de espécies descritas, e, apesar de tratar-se de um gênero com alta variabilidade genética, a validade de algumas dessas espécies vêm sendo questionada. A associação entre Leishmania spp. e as diferentes formas clínicas sugere a participação do parasita na manifestação e no prognóstico da doença. Métodos moleculares estão sendo cada vez mais empregados para diagnóstico, estudos taxonômicos, filogenéticos e epidemiológicos envolvendo este parasita. Os métodos utilizados são, entretanto, diversos, comprometendo a reunião de dados e a comparação inter-laboratorial. Sendo assim, o desenvolvimento de um marcador único e robusto, que permita a troca de informações, enriquecerá o conhecimento sobre a diversidade fenotípica e molecular das leishmânias, atendendo tanto a demanda por uma revisão taxonômica do gênero, como para a elaboração de um sistema integrado de identificação e tipagem deste organismo, ponto essencial em estudos epidemiológicos. O principal objetivo deste trabalho foi desenvolver marcadores multilocus para Leishmania (Viannia) e avaliar sua aplicabilidade em estudos epidemiológicos Os objetivos específicos incluíram: i) o desenvolvimento de um painel multi locus sequence analisys (MLSA) para cepas de Leishmania (Viannia) que circulam no Brasil que permita, concomitantemente, a identificação de isolados e a realização de estudos filogenéticos; ii) o estudo da estrutura da população de cepas de Leishmania (Viannia) quanto à clonalidade e ocorrência de eventos de recombinação pela determinação de perfis de microssatélites; iii) avaliação da aplicabilidade do painel MLSA como ferramenta epidemiológica para as leishmanioses; iv) a descrição de eventos moleculares em leishmânia que podem interferir nos resultados obtidos a partir de marcadores moleculares empregados. Após construção do painel MLSA e determinação de perfis de microssatélites (MLMT) foi possível comparar os dois marcadores. Os resultados a partir de MLMT definiram duas populações principais, uma com cepas de L. (V.) guyanensis da região Amazônia e outra apresentando as cepas de L. (V.) braziliensis, oriundas da costa Atlântica brasileira. Um terceiro grupo, muito heterogêneo, pôde ser definido com cepas de L. (V.) braziliensis da região norte e com as cepas das espécies L. (V.) shawi, L. (V.) naiffi, e L. (V.) lainsoni. Sinais de recombinação foram detectados no grupo formado por cepas identificadas como L. (V.) guyanensis e também naquele composto por cepas de L. (V.) braziliensis da região costeira. A recombinação pode ser uma das justificativas tanto para a grande diversidade encontrada como para a ausência de estruturação clara da população. O MLSA separou as espécies de acordo com a classificação prévia, exceto para L. (V.) shawi e também apontou para ocorrência de recombinação pelo padrão reticulado das redes construídas Ao aplicar o MLSA em uma situação de surto em Santa Catarina, se detectou associação entre características epidemiológicas dos pacientes e os grupos MLSA, com separação de casos importados e autóctones, sinalizando para o potencial como marcador epidemiológico. A partir dos dados MLSA também foi possível realizar um estudo sobre a ocorrência de variação intra-cepa detectada em sequências de DNA de isolados clonados de Leishmania. Foi possível concluir que o painel MLSA construído e validado apresenta-se como boa alternativa para tipagem, estudos taxonômicos e epidemiológicos em L. (Viannia). Como tal pode representar tanto um substituto molecular para o multilocus enzyme electroforesis (MLEE), método-ouro para tipagem de Leishmania, quanto um marcador padrão a ser utilizado em revisão taxonômica do gênero. Mesmo com o advento do sequenciamento completo de genomas, a contribuição do MLSA ainda é relevante, e este se apresenta como potencial marcador epidemiológico, apesar da inclusão de novos genes ser necessária. O estudo com MLMT evidenciou que o mesmo é ferramenta de escolha para estudos de genética de populações em L. (Viannia), mas não para identificação e avaliação taxonômica do subgênero. Demonstrou-se ainda que a plasticidade genômica das leishmânias gera diversidade em tipos de sequencia de DNA e, portanto deve ser sempre considerada em estudos baseados em marcadores moleculares