Desenvolvimento de aptâmeros neutralizantes dirigidos à proteína E2 do vírus chikungunya - Purificação Júnior, Antonio Fernando da (2022)
A infecção por CHIKV provoca uma grave doença febril caracterizada por uma poliartrite debilitante, que pode persistir por anos. Atualmente, não há nenhum tratamento e vacina contra o CHIKV. A proteína de envelope E2 de CHIKV é o principal sítio de interação com receptores celulares durante a infecção de células hospedeiras. Ademais, o mapeamento de epítopos de anticorpos induzidos por CHIKV mostrou que a proteína E2 é o principal alvo dos anticorpos neutralizantes. Neste contexto, nós hipotetizamos que o desenvolvimento de moléculas inspiradas em anticorpos neutralizantes dirigidas contra epítopos específicos do domínio B da proteína E2 podem ser capazes de ligar-se e neutralizar o CHIKV em ensaios in vitro. Para tal, este trabalho explorou as características estruturais de epítopos da E2Bafim de criar aptâmeros de alta afinidade. As propriedades estruturais e dinâmicas dos candidatos mais promissores foram avaliadas, e com base nas previsões teórica foram selecionados três aptâmeros CETZDT-2, CETZDT-3 e CETZDT-7 para serem expressos em E. coli. Usando ensaios de termoforese em microescala, foi determinada a afinidade de ligação desses aptâmeros ao CHIKV e o CETZDT-2 foi capaz de reconhecer seu alvo antigênico com afinidade comparável a de anticorpos naturais (KD= 100nM). A avaliação da manutenção das propriedades estruturais, por dicroísmo circular, mostraram que CETZDT-2 é extremamente estável, preservando seu conteúdo de estrutura secundária mesmo em altas temperaturas. Ensaios de neutralização (redução de placa e microneutralização) demonstraram que o CETZDT-2 foi capaz de neutralizar a infecção por CHIKV in vitro, com EC50 iguais à 31,44μMe 107,4μM. Devido a similaridade de epitopos da E2B entre os alfavírus, resolvemos testar a capacidade de neutralização do CETZDT-2 frente o MAYV, e verificou-se que com EC50 de 79,45μM a proteína apresenta potencial neutralizante in vitro. Diante disso, nossos resultados indicam que a proteína desenhada tem potencial aplicação como marcador de diagnóstico de infecções agudas, bem como em novas estratégias terapêuticas contra a infecção por CHIKV e MAYV.