Isolamento, purificação e caracterização de duas proteínas recombinantes de leishmania chagasi,visando à padronização de um ensaio imunodiagnóstico para leishmaniose canina - Souza, Cristiane Marques de (2009)
A leishmaniose visceral (LV) causada pelo parasito Leishmania chagasié uma doença severa que ocorre em seres humanos sendo prevalenteem vários países, inclusive no Brasil. Trata-se da forma com maior potencial de letalidade. Os cães são importantes reservatórios do parasito, portanto o diagnóstico canino é essencialpara os programas de vigilância da LV. Neste trabalho é relatado a expressão, o isolamento e a purificação de dois antígenos recombinantes protéicos de Leishmania chagasi, Lc9 e Lc13, produzidos em Escherichia coli visando um imuno-ensaio para o diagnóstico desta enfermidade. Inicialmente, os plasmídeos de E.coli contendo os gens inseridos e relacionados a ambas as proteínas foram analisados por eletroforese de agarose. A proteína Lc9, por conter um marcador de seis histidinas, foi purificada por cromatografia de metal imobilizado (Ni) seguido porcromatografia de exclusão e peneiração molecular em Superdex 200. A Lc13 foi purificada, somente, por cromatografia de perfusão de troca aniônica em Poros HQ. As preparações protéicas purificadas tiveram suas homogeneidades verificadas por eletroforese desnaturante (SDS-PAGE), focalização isoelétrica e western blot. Um pI estimado de 6,43 e de 6,42 foi observado paraLc9 e Lc13, respectivamente. A determinação de peso molecular (PM) feita por SDS-PAGE-10% indicou valores de 44000 (Lc9) e 88000 (Lc13), enquanto por cromatografia de exclusão e filtração molecular em Superdex 200, os valores estimados foram de 550.000 (Lc9) e 282.000 (Lc13). Estes valores estimados de PM sugerem que ambas macromoléculas apresentam-se em seu estado nativo na forma multimérica, sendo ambas constituídas por cadeias polipeptídicasidênticas. As diferentes detecções protéicas depois do SDS-PAGE de Lc9 e Lc13 purificadas mostraram que a principal banda imuno-revelada corresponde a principal banda revelada como coomassie brilliant blueR-350 por igual metodologia. Concluindo-se então que ambas correspondem ao principal antígeno presente em cada uma das duas preparações protéicas (Lc9 e Lc13) purificadas. Para o desenvolvimento de um ELISA indireto, relacionado ao diagnóstico da leismaniose visceral canina, os antígenos, Lc9 e Lc13 e o conjugado IgG – peroxidase tiveram as faixas de concentrações selecionadas para uso no referido ensaio sorológico. Segundo a mesma metodologia, o antígeno Lc9 apresentou melhores resultados que o antígeno Lc13 (Lc9: sensibilidade 100%; especificidade 95% e Lc13: sensibilidade 96%; especificidade 92%). Os resultados obtidos propõem o uso das proteínas recombinantes Lc9 e Lc13, principalmente a primeira, num imuno-ensaio baseado em ELISA para o aperfeiçoamento do diagnóstico da leishmaniose.