Caracterização molecular da regulação pós-transcricional durante a diferenciação cardiomiogênica - Pereira, Isabela Tiemy (2019)
A diferenciação de células-tronco pluripotentes é um processo coordenado que envolve o gatilho, a manutenção e o controle dos padrões de expressão gênica. O presente trabalho teve como objetivo analisar as frações de RNAs livre e polissomal como uma estratégia para investigar mecanismos de regulação pós-transcricional envolvidos na diferenciação cardiomiogênica de células-tronco. A linhagem de células embrionárias humanas NKX2-5eGFP/w foi cultivada e diferenciada à cardiomiócitos e submetida à análise em cinco diferentes pontos ao longo da diferenciação (dias D0, D1, D4, D9 e D15) usando polysome profiling e sequenciamento de RNA em larga escala (RNA-seq). Os resultados mostraram que os RNAs polissomais refletem o fenótipo das células em diferenciação e que um grande número de RNAs está sob efeito de regulação pós-transcricional. Vias relacionadas à tradução apresentaram-se reguladas negativamente após a diferenciação, e constatou-se que cardiomiócitos diferenciados apresentaram níveis de síntese proteica menores que as células pluripotentes. Além disso, os genes SHISA3, RXRG e CSDC2 foram escolhidos para serem avaliados funcionalmente na diferenciação cardíaca usando linhagens de expressão induzida. As novas linhagens foram geradas a partir da linhagem hESC H1 e mostraram manutenção da pluripotência após indução da expressão dos genes com doxiciclina, indicando que os genes em questão não parecem estar envolvidos com a manutenção ou escape da pluripotência. Por outro lado, a super expressão de CSDC2 entre os dias D7-D10 da diferenciação cardíaca mostrou um aumento significativo na expressão de genes cardíacos, como TNNT2 e TNNI3, sugerindo uma possível contribuição na diferenciação e/ou maturação de cardiomiócitos. Os dados de RNAseq também possibilitaram a análise de RNAs não-codificantes longos (lncRNAs) expressos durante a diferenciação cardiomiogênica. Tais lncRNAs mostraram um padrão de expressão temporal ao longo da iferenciação, e um grande número mostrou-se diferencialmente associado aos polissomos. O lncRNA LINC00890 se apresentou expresso em progenitores cardiacos e foi escolhido para a avaliação funcional. Linhagens de expressão induzida e com o LINC00890 silenciado foram construídas e submetidas à diferenciação cardiomiogênica. A super expressão de LINC00890 entre os dias D5-D10 mostrou indícios do favorecimento na maturação de cardiomiócitos e na determinação de propriedades eletrofisiológicas de células atriais. O silenciamento de LINC00890 usando a técnica de CRISPR/Cas9 foi feito nas linhagens hESC H1 e iPSC PLZ, e as células silenciadas foram capazes de se diferenciar até o estágio de mesoderme, mas não em cardiomiócitos, indicando um possível papel essencial desse lncRNA na diferenciação cardiomiogênica.