Obtenção e caracterização de leishmania infantum deficiente para o gene LPG2 - Santos, Flávio Henrique (2019)
INTRODUÇÃO: O glicoconjugado LPG é uma das moléculas dominantes na superfície do estágio de promastigota de Leishmania. Este fator de virulência multifuncional participa em uma variedade de processos durante o estabelecimento da infecção no hospedeiro mamífero. Além do LPG, esses protozoários possuem em sua superfície outras moléculas como os PPGs,PGs e sAP que contribuem para a sobrevivência da Leishmania dentro da célula hospedeira,Umas das enzimas essenciais para síntese do LPG e destas outras moléculas contendo fosfoglicanos (PGs) em sua estrutura é a GDP-manose transferase que é codificada pelo gene LPG2. OBJETIVOS: Caracterizar a estrutura do gene LPG2 no genoma de L. infantum (MCAN/BR/89/BA262). Obter parasitas lpg2-/- e caracteriza-los molecularmente e avaliar sua virulência em ensaios de infecção de macrófagos in vitro. MÉTODOS: A edição do genoma foi realizada utilizando o método clássico de recombinação homóloga com marcadores de resistência a antibióticos, e posteriormente com o sistema CRISPR/Cas9. Os parasitas nocautes foram selecionados utilizando ensaios de aglutinação com anticorpo CA7AE e com a lectina (RCA 120). RESULTADOS: O processo de obtenção dos parasitas nocautes por recombinação homóloga se demonstrou inviável devido a presença de uma cópia adicional do gene LPG2 no genoma de L. infantum que não havia sido descrita anteriormente. Esse resultado nos levou a utilizar o sistema CRISPR/Cas9 para a interrupção do gene LPG2 nesta espécie. Cinco clones foram isolados após as etapas de seleção utilizando o anticorpo CA7AE e posteriormente a lectina (RCA 120). Os resultados obtidos com o sequenciamento mostraram a ocorrência da edição esperada no genoma em todos os clones. Além disso, o resultado do Western blot mostrou a perda completa da expressão do LPG e de PGs. Os resultados de curvas de crescimento mostram que todos os clones lpg2-/- apresentam um fenótipo (morfologia) e uma taxa de crescimento similar, sugerindo a ausência de efeitos de edição inespecíficos “offtargets”. Ensaios preliminares de infecção de macrófagos murinos in vitro utilizando os parasitas lpg2-/-, demonstram uma redução na taxa de infecção (4h - 34,5% e 72h - 34,6%) além de uma diminuição na carga parasitária (4h - 46,2% e 72h - 49,9%). CONCLUSÃO: O gene LPG2 está duplicado em L. infantum e foi nocauteado com sucesso utilizando o sistema CRISPR/Cas9. Os dados dos ensaios de infecção reforçam a importância do LPG e outros PGs como fatores de virulência na interação parasito-hospedeiro.